181434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív FR-900156 anyag előállítására
11 181434 12 A találmány szerinti vegyület védőhatása egerek kísérleti fertőzésekor Az egerek kísérleti fertőzéssel szembeni védőhatás meghatározására az FR—900156 jelű vegyületet steril vízben oldjuk, és háromszoros hígításokat készítünk szintén steril vízzel. A kísérlet során 6 hetes és 24—26 g súlyú hím DD Y-törzsbe tartozó egereket használunk csoportonként 4 állattal. Difco Nutrient Broth-ban (Difco) Escherichia coli No. 22 sejteket tenyésztünk egy éjszakán át, majd friss táptalajjal 100-szorosra hígítjuk a tenyészetet, és 30 C° hőmérsékleten rázás közben folytatjuk a tenyésztést. Amikor a tenyészet milliliterenként 1 x 108 sejtet tartalmaz, 0,2 ml tenyészetet intraperitoneálisari beoltunk az állatoknak. Az összes, az antibiotikummal nem kezelt állat a fertőzést kővető 48 órán belül elpusztul. A fertőzést megelőző első, negyedik, ötödik és hatodik napon 0,2 ml FR—900156 jelű vegyületet tartalmazó oldatot injektálunk szubkután. A fertőzést követően két nap múlva a kísérlet befejeződik, és meghatározzuk a túlélők számát. A kísérlet eredményeit a 3. táblázatban adjuk meg. 3. táblázat Dózis (p/egér/nap) Túlélők száma/fertőzöttek száma 0,01 10/10 0,003 10/10 0,001 10/10 0,0003 8/10 0,0001 4/10 kontroll 0/10 4. Rákellenes hatás A kísérlet során nőstény patkányokat használunk (Donru törzs), koruk hat hét, csoportonként három állat. Az állatoknak 0,5 ml Hank-oldatban lévő ascites hepatoma AH66 sejteket transzplantálunk intraperitoneálisan, állatonként 5 x 104 sejtet. 13 nappal később az összes állat aszkitesz rákban elhullik. A hatás kritériuma a túlélési idő meghosszabbítása a kontrollal szemben. A terápiás kezelést a tumor transzplantációját megelőző 5., 6., 7., 8. és 9. napon végezzük. Az FR—900156 vegyületet steril fiziológiás sóoldatban oldjuk, és hígítjuk, oly módon, hogy háromszoros hígításokat kapjunk. Az oldatot intraperitoneálisan adjuk az állatoknak. A kísérletek eredményeit a 4. táblázatban adjuk meg. 4. táblázat Dózis (mg/patkány/nap) Élettartam (nap) 1,0 14 >30 >30 0,3 13 >30 >30 0,1 13 >30 >30 0,03 13 13 13 kontroll (sóoldat) 13 13 13 5. A szén kitisztulása a véráramból Reagensek: 1. Szén-szuszpenzió: tus, amely milliliterenként 170 mg szenet tartalmaz, és amit 1% zselatint tartalmazó fiziológiás sóoldattal eredeti koncentrációjának Vs-ére hígítottunk. 2. 0,1%-os vizes nátrium-karbonát oldat. Az eljárás leírása: Hímnemű DDY 5—6 W egereket a farki vénán beoltunk testsúlykilogrammra számítva 0,01 ml szénkészítménnyel. A vérmintákat előzőleg heparinban mosott 50 pl térfogatú kalibrált pipettával vesszük. A pipettát a retroorbitális vénába juttatjuk a szem nazális sarkában. A mintákat 3 és 6 percenként vesszük. A vért a mintavételt követően azonnal 3,0 ml nátrium-karbonát oldatba engedjük. Ez az oldat hemolizálja a vért, és így lehetővé válik a szén mennyiségi meghatározása. Ezután 660 nm hullámhosszon spektrofotométeren vizsgáljuk a mintákat, a szén logaritmikus koncentrációját előzőleg meghatározott standard görbéből számítjuk. A K tisztulási értéket úgy kapjuk meg, hogy a szén koncentrációját a megfelelő időben az alábbi egyenlet szerint számítjuk: _ (log Ci—log C2) ahol Ti és T2 azt a percben megadott időt jelenti, amikor a vérmintát vettük, és ahol Cj és C2 a Ti és T2 időben vett vérminta szénkoncentrációja. Az FR—900156 jelű vegyület szén kitisztulásra kifejtett hatásának vizsgálata, A hatóanyagot az előzőekben ismertetett módon előállított vizes oldatban adagoljuk szubkután az egereknek. 24 órával később meghatározzuk a szén eltűnését a vérből. A kezelt egerekkel kapott K-értéket összehasonlítjuk a kontroll állatokkal kapott eredménnyel. A kísérlet eredményeit az 5. táblázatban adjuk meg, 5. táblázat Különböző hatóanyagok hatása a szén-kitisztulásra Hatóanyag Dózis (mg/egér) Kezelt/ Kontroll Krestin 10 u í 1,0 Levamísol 10 — (halál) 1 0,5 Tuftsin 400 1,4 125 1,0 FR—900156 0,25 2,9 vegyület 0,06 1,5 Kontroll (sóoldat) 1,0 6. Interferon-indukáló aktivitás 4—6 hetes hím ICR egereket használunk a kísérlet során. Az egerek lépét eltávolítjuk, és a lépsejtek interferon termelő képességét in vitro vizsgáljuk FR—900156 vegyület jelenlétében. Lépsejt szuszpenziót állítunk elő 100 p/ml sztreptomicinnel, 100 p/ml G penicillinnel, 1% glutaminnal és 5 x 10 5 * mól 2-merkapto-etanollal kiegészített RPMI—1640 táptalajjal. A szövetsejt tenyészetet 37 C° hőmérsékleten addig inkubáljuk FR—900156 jelű vegyület jelenlétében, vagy anélkül, míg 4 x 107 sejt/ml koncentrációt érünk el; a hatóanyag dózisa: 100, 10 és 1 pg/ml. 24 óra múlva összegyűjtjük a tenyészetek felülúszóját, és citopatikus hatás gátláson alapuló L sejt—VSV rendszerben meghatározzuk az interferon-aktivitásokat. A vírusellenes titert IU/ml-ben adjuk meg standard interferonra vonatkoztatva. A kísérlet eredményeit a 6. táblázaton adjuk meg. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
