181434. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív FR-900156 anyag előállítására
9 181434 10 miai tulajdonságait meghatároztuk, a minta olvadáspontja 147—153 C° (bomlik); a minta további tulajdonságai az előzőekben megadottal azonosak voltak. A fenti fiziko-kémiai tulajdonságok analízise és további, a kémiai szerkezet meghatározására végzett vizsgálatok alapján a találmány szerinti FR—900 156 jelű vegyidet kémiai szerkezetét az (I) képléten megadottal tekintjük azonosnak. A vegyidet D-laktil-L-alanil-y-D-glutamil-(L)-mczo-diamino-pimelil-L-glicin. Az alábbiakban ismertetjük az FR—900 156 vegyület biológiai tulajdonságait. Az FR—900 156 vegyület és a gyógyszerészeti szempontból elfogadható sói hatásosak az immúnválaszra (azaz aktívak a sejtimmunitás és a humorális antitest képzésben), és a retikulo-endotheriális rendszerre, aktivitással rendelkeznek a szénnek a vérből való kiürülésére, nitrogén aktivitással bír, interferon inducer, kísérleti fertőzéssel szemben véd, és rákellenes hatással rendelkezik. A fentiek alapján az FR—900 156 jelű vegyületet és gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóit patogén mikroorganizmusok, különösen Gram-negatív, Gram-pozitív baktériumok és gombák okozta fertőző megbetegedések terápiás kezelésére és az ember és az állatok rákos elváltozásának kezelésére használjuk. Az alábbiakban az FR—900 156 jelű vegyület gyógyszerészeti felhasználhatóságának bizonyítására farmakológiai vizsgálatokat ismertetünk. 1. A sejtimmunitás és a humorális antitest képzés növelése 5 állatot tartalmazó tengerimalac csoportoknak 50 pg ovalbumint tartalmazó 0,1 ml FIA (Freund Inkomplett Adjuváns) emulziót adunk a hátsó lábakba. A kontroll csoportok a FIA-ban antigént kapnak, míg a vizsgált csoport az antigént és az FR—900 156 vegyületet kapja a FIA emulzióban. Az állatokat a 14. napon a bőrükön vizsgáljuk, a 16. napon pedig a vérüket teszteljük. A kísérletek eredményeit az 1. táblázatban adjuk meg. 1. táblázat Dózis (Hg/hely) Sejdmmunitás borreakciók (mm átmérő, S. E.)* Humorális immunitás Hemagglutinációs titer (M * S. E.) (lógó** Hemilizin titer (M ± S. E.) (logr)** 0 0 9,1 ±0,19 4,5 ±0,45 0,1 0,2 ±2,8*** 9,9±0,10*** 6,4 ±0,76 1 14,5±2,1*** 11,5±0,61*** 7,7 ±0,64*** 10 11,0 ±1,3*** 12,2±0,56*** 7,1 ±0,58*** 100 4,2± 1,7*** 10,0± 1,01 5,9±0,89 Megjegyzés: * A bőrvizsgálatot a háton végeztük oly módon, hogy 0,1 ml fiziológiás sóoldatban lévő 5 pg mennyiségű antigént intradermálisan injektáltunk. A vizsgált helyen a bőrreakciót 48 óra múlva vizsgáltuk. ** Az antitest becslést az alábbiak szerint végeztük: króm-kloriddal ovalbuminnal kezelt juh vörösvérsejteket állítunk elő. Az antitest titert annak a legnagyobb szérumhígításnak a reciprokával adjuk meg, amely küszöb hemoagglutinációt és hemolízist okoz. Az eredményeket kettes alapú logaritmus egységekben adjuk meg. *** A szignifikanciát Student t-számítással számítjuk; P<0,05. Az FR—900 156 mitogén aktivitása egér rosszindulatú sejtekben Anyagok és módszerek 1. Állat: A kísérlet során hím BALB/C törzsbe tartozó egereket használunk, koruk 13 hét (első vizsgálat). A második vizsgálat során 9 hetes BALB/C törzsű nőstény állatokat vizsgálunk. 2. Szövettenyészet táptalaja: A használt szövettenyésztő táptalaj a Roswell Park Memorial Institute (RPMI)—1640 jelű komplett táptalaj. Az összes táptalaj 100 egység/ml G penicillint és 100pg/ml sztreptomicin-szulfátot, továbbá 10% borjúszérumot tartalmaz. 3. Sejtpreparáció: A rosszindulatú daganatokat steril körülmények között eltávolítjuk, Hanks-oldattal mossuk, és ezt követően szövettenyésztő táptalajba helyezzük. A szövettenyésztő táptalaj ily módon milliliterenként 8x10® sejtet tartalmaz. 4. A tenyésztés körülményei: Mindegyik Microtest II szövettenyésztő lemez lyukaiba (8x12 lyuk) (Folcon Plastics Co. terméke) 0,1 ml fenti sejtszuszpenziót és 0,1 ml az alábbiakban megadottak szerint előállított és vizsgált vegyületet tartalmazó koncentrátumot helyezünk, majd 37 C° hőmérsékleten nedves légben (95% levegő és 5% széndioxid) 48 órán át inkubáljuk. A kontroll tenyészetek 0,1 ml táptalajt tartalmaznak a vizsgált vegyületet tartalmazó koncentrátum helyett. 5. Timidin3H-felvétel: Mindegyik vizsgálat során a tenyésztés utolsó 24 órájában 20 pl milliliterenként 10 pCi aktivitású triciált timidint (3H-timidin) adunk mindegyik lyukba. A tenyésztés befejezését követően szűrőpapírral (Whatman GF 83) szűrjük a sejteket, fiziológiás sóoldattal, majd 5%-os triklór-ecetsavval mossuk a szűrési maradékot. Megszárítjuk a szűrőpapírt, és szcintillátorba helyezzük (0,1 g para-bisz-[5-fenil-oxazolil]-benzolt és 4 g 2,5-difenil-oxazolilt tartalmazó 1 liter térfogatú toluol), és mérjük a dezoxi-ribonukleinsavba beépült radioaktív timidin3H-t. 6. Stimulációs index: timidin3H-felvétel (tiszta beütés/perc) a kezeiteknél timidin3H-felvétel (tiszta beütés/perc) a kontrolinál 7. Vizsgált vegyület: FR—900 156 jelű vegyület. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. 2. táblázat Koncentráció (Mg/tnl) TimÍdin3H-felvétel, tiszta beütés/perc: av±S. E. Stimuláció index 1. vizsgálat 100 2028± 89 4,9 10 1486± 120 3,6 1 835± 64 2,0 0 417 ± 13 1,0 2. vizsgálat 100 3666± 42 4,1 10 3223 ±402 3,6 1 2741 ±319 3,0 0 901 ±105 1,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
