181413. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóztartalmú szacharid készítmény előállítására
13 181413 14 Szekunder Végtermék (B) Kiindulási 1 óra 2 óra szubsztrát (A) (°/o) anyag (%) (B termék) Fruktóz 2,4 15,7 Fruktóz 15,7 60,3 59,1 Dextróz 32,8 18,9 5 Dextróz 18,9 38,7 37,9 dp2 10,6 11,0 dp2 11,0 1,9 2,6 dp3 22,9 22,9 dp3 22,9 0,4 0,3 D?4+ 31,3 31,5 dp4+ 31,5 0 0,2 Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a szekunder szubsztrátban lévő szabad dextróz 42,38%-a izomerizálódott az oszlopon fruktózzá. A szekunder szubsztrátban jelenlévő fruktóz-polimerekre úgy tűnik nem hat a dextróz fruktózzá történő izomerizációja. Megjegyzendő, hogy az összes monoszacharid körülbelül 45%-a fruktóz és 55%-a dextróz. A következő példában két módszert alkalmazunk a szekunder szubsztrátban és ennek izomerizációs termékében levő poliszaharidok hasítására. Az egyik kísérlet enzimes, a másik enyhe savas hidrolízist alkalmaz. 7. példa Nagy fruktóztartalmú szirup előállítása hidrolízissel. A) Enzimes hidrolízis. A 6. példa B termékének 100ml-éhez 10 mg tisztított invertázt adunk, amely Candida utilisből származik. Ezt az elegyet (toluollal tartósítva) éjszakán át szobahőmérsékleten hagyjuk reagálni, utána mintát veszünk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk. A maradékot további 6 napig hagyjuk reagálni, és utána újabb mintát veszünk, amelyet hasonló módszerrel vizsgálunk meg. A következő eredményeket kapjuk: Kiindulási Invertáz További hat anyag (B termék) hatása után nap múlva Fruktóz 15,7% 41,9% 62,4% Dextróz 18,9% 29,4% 36,2% dp2 n,o% 1,9% 0 dp3 22,9% 12,9% 0,5% DP4+ 31,5% 13,9% 0,9% A felhasznált invertáz a Siekagaku Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan cég által gyártott enzimkészítmény, amelynek aktivitása 123 egység/mg, ahol a szacharóz hasítását katalizáló 1 egység invertáz 1 mikromól glükózt és 1 mikromól fruktózt termel percenként meghatározott körülmények között. B) A B termék savas hidrolízise. A 6. példa B termékének savas hidrolízisét úgy végezzük, hogy 0,05 n koncentráció eléréséig kénsavat adunk hozzá, és 75—80°C-on melegítjük. Egy és két óra hidrolízis után mintákat veszünk, és nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk. Az eredmények a következők: Az A pontban előbb kapott eredmények jelentős növeke- 10 dést mutatnak a fruktóz hozamban, és kisebb növekedést a glükóz hozamban a DP2, DP3 és DP4+ frakciókban beállott megfelelő csökkenéssel együtt, így bizonyítva fruktóz-polimer jelenlétét. A B pontban a savas hidrolízis során kapott eredmények 15 összhangban vannak az A pontban kapottakkal, így szintén fruktóz-polimerek hasítását bizonyítják. Az előbbiekben tárgyaltak olyan transzfruktozilezésre vonatkoznak, amelynek során olyan primer szubsztrátot használtunk, ahol a kiindulási szacharózoldat szárazanyagtartal- 20 ma nem haladta meg a telítési pontot az adott reakciókörülmények között. A következő példa olyan primer szubsztrátkoncentráció alkalmazását mutatja be, ahol a kezdeti szacharózkoncentráció a telítésinél több, és amely a fruktoziltranszferáz enzim hatására magasabb koncentrációban ered- 25 ményez DP3 anyagot (azaz fruktozil-szacharózt), és kisebb koncentrációban DP4+ termékeket. Növekedés észlelhető a szekunder szubsztrát szárazanyagkoncentrációjában is a fruktozil-transzferáz enzim hatása nélkül kapott szárazanyagkoncentrációhoz képest. Kimutatjuk továbbá, hogy 50 ha a primer szubsztrát szárazanyagkoncentrációja nő, akkor csökken a szekunder szubsztrátban a fruktóz polimer polimerizációs foka, és a DP4+ anyag kismennyiségben van jelen. Ez élesen eltér az előző példákban a telítésinél kevesebb szacharóz szubsztrát alkalmazásával kapott eredményektől. 55 Ezekben a példákban a DP4+ anyag az elsődleges termék. 8. példa 40 Szekunder szubsztrát előállítása a telítésinél több szacharózt tartalmazó szuszpenziókból. 200 g élelmiszer minőségű szacharózt teszünk csavaros fedéllel ellátott egy pint űrtartalmú csészékbe. Kontrollként 50 ml vizet teszünk az egyik csészébe, a többibe pedig növek- 45 vő mennyiségű Celitre kötött fruktozil-transzferáz enzimet (amelyet az 1. példa szerint állítottunk elő) 50 ml vízben, amint a következő táblázatban látható. Az egyes csészéket lezárjuk, és rázható vízfürdőbe helyezzük 54—55 °C-on. Az edényeket 24 órát rázatjuk, időnkénti kézi keveréssel. Az 50 egyes csészék felülúszóiból mintát veszünk, és csavaros fedelű kémcsőbe téve forró vízfürdőben inaktiváljuk az enzimet. A mintákat utána nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk, és szárazanyag tartalom meghatározást végzünk (K. Fischer módszer), amelyek eredményeit a következő 55 táblázatban láthatjuk: Csésze száma Szacharóz Enzim1 egység Szárazanyag a fe* lülúszóban (s%) S.énhidrátösszetétel az oldatban nagynyomású folyadékkromatográfiával (%) frukt. dextr. dp2 dp3 dp4+ í 200 100 74,5 0,6 9,6 80,9 8,9 ND2 2 200 200 75,6 0,7 12,7 72,2 13,7 0,7 3 200 300 76,3 1,0 14,5 66,8 16,6 1,1 7
