181413. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóztartalmú szacharid készítmény előállítására
7 181413 8 pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,0-re állítjuk. Még egyszer átengedjük a Sharpies centrifugán, így már csak gyengén színes, viszkózus felülúszót kapunk. A derített felülúszó pH-ját sósavoldattal 5,5-re állítjuk, majd 1000 egység (3 806 419. sz. amerikai szabadalomban megadott definíció szerint) pullulanázt adunk hozzá. A kapott levet telítésig adagolt toluollal tartósítjuk, és a pullulanázt éjszakán át hagyjuk szobahőmérsékleten reagálni. A pullulanázzal való éjszakán át tartó feltárás után 1% Grefco No. 503 Celitet (Johns—Mainville Products Corporation, Lompoc, California) szuszpendálunk a lében, majd 2 térfogat (24 liter) acetont adunk hozzá. Csapadék keletkezik, amelyet kiszűrünk, majd a szűrőlepényt acetonnal lemossuk, és szobahőmérsékleten megszólítjuk. A szűrőlepény tartalmazza a kötött fruktozil-transzferáz enzimet. Az 1. példával kapcsolatban megjegyzendő, hogy a kalcium-kloridnak a fermentléhez történő hozzáadása és a pH- állítás a fekete pigment és a savas poliszacharidok eltávolítását szolgálja. [A savas poliszacharidokra vonatkozólag lásd: Acta Chem. Scand. 16, 615—622 (1962)]. A végső enzimkészítményt ennélfogva viszonylag tiszta, színtelen készítményként kapjuk. Ez a tisztítási eljárás a találmány előnyös megvalósítását képezi, és a végtermék nyerése céljából egyszerű tisztítási műveleteket, azaz centrifugálást, szűrést vagy kicsapást alkalmaz. így ez a megvalósítás eljárást bocsát rendelkezésünkre savas poliszacharidok és fekete pigment melléktermékek eltávolítására a Pullularia pullulans fekete élesztő végső fermentleveiböl. A módszer a fermentációs eljárás során keletkező nem kívánt pigment és savas poliszacharid melléktermékektől mentes végső enzimkészítményt szolgáltat. Eltávolítás nélkül ezek a melléktermékek együtt válnak ki az enzimmel, mikor a fermentléhez oldószert adunk. A találmány szerinti tisztított enzimkészítmények tovább tisztítása céljából kívánatos a fermentlében mindig jelenlévő pullulan poliszacharid eltávolítása, mivel ez szintén együtí válik ki a fruktozil-transzferáz enzimmel, mikor oldószeri adunk a fermentléhez. Ezért a kalcium-kloridos kezelés és pH-állítás után kapott felülúszót tovább kell kezelni a jólis mert hidrolizáló enzimmel, a pullulanázzal. A pullulaná; enzim véletlenszerűen hidrolizálja a pulialant, és kisebb mo lekulasúlyú polimert termel. így elkerülhetjük, hogy az oldó szer (például aceton, alkohol vagy hasonló) hozzáadásakor a fruktozil-transzferáz enzimkészítménnyel együtt kiváljon és szennyezze a terméket a pullulan. A fruktozil-transzferá; enzim ily módon történő tisztítása a találmány egy újabt megvalósítását jelenti. A találmány szerinti fruktozil-transzferáz enzimkészítmények a pullulan eltávolítása nélkül is használhatók. A talál mány a gyakorlatban a pullulan pullulanázzal történő hidrolízise nélkül is alkalmazható, ebben az esetben a pullulan szolgál a fruktozil-transzferáz enzim hordozójaként. A következő példa szemlélteti a pullulan hordozóként 5 történő felhasználását. 2. példa Szekunder szubsztrát előállítása pullulan hordozóra kö- 10 tött fruktozil-transzferáz enzim alkalmazásával. 0,05 mólos 5,5 pH-jú citrát-pufferral pufferolt 20%-os szacharóz oldathoz 1% száraz pullulant adunk, és az 1. példa eljárása szerint kezeljük, azzal az eltéréssel, hogy a pullulant nem hidrolizáljuk el pullulanázzal, így ez szolgál hordozó- 15 ként, és nem használunk Celitet. A fruktozil-transzferáz aktivitás 677 egység/gramm pullulan. A reakciót szobahőmérsékleten végezzük, amíg az elegy zavarosodni kezd. Az anyag egy mintáját nagy nyomású folyadékkromatográfiával analizáltuk, és a következő eredményeket kaptuk: 20 Szacharid megoszlás nagy nyomású folyadékkromatográfiás analízis szerint: Fruktóz Dextróz DP2 DP3 DP4 6,9 40,6 6,2 11,1 35,2 Az 1. példában előállított enzimet az alábbi módon alkal- 25 mázzuk. 3. példa 30 Az enzimes kezelés termékei és az enzim hőstabilitása. Csavaros kupakkal ellátott reakcióedényekbe 60 g étkezési minőségű szacharózt és fruktozil-transzferáz enzimkészítményt töltünk be. Az enzimkészitményt az 1. példában előállított enzimtermékből készítjük úgy, hogy megfelelő mennyi- 35 ségű szilárd Celiten kötött enzimet szuszpendálunk mért mennyiségű vízben alkalmas koncentrációjú enzimoldathoz. A Celitet utána szűréssel eltávolítjuk. A szűrletet használjuk fel; a reakcióelegyhez egy gramm szacharóz-szubsztrátra számítva 10,20 és 30 egység enzimet adunk. Az egyes elegye- 40 két utána vízzel 100 ml végtérfogatra hígítjuk. Az inkubálást 66 órán át végezzük pH 5,5-ön és 55 °C vagy 60 °C hőmérsékleten. Mintákat veszünk 24, 43 és 66 óra után redukáló cukor meghatározásához, hogy megállapítsuk az enzimaktivitást. Miután a redukáló cukor meghatározásokat elvégez- 45 tűk a mintákon, a reakcióelegyeket megfagyasztjuk, hogy leállítsuk az enzimműködést, és a mintákat nagy nyomású folyadékkromatográfiával szénhidrátösszetétel-meghatározásnak vetjük alá. A következő eredményeket kaptuk: 1 táblázat Redukáló cukor meghatározás1 Hőfok ■c Enzimmennyiség2 Redukáló cukor mg/ml pH Red akáló cukor mg/ml pH Redukáló cukor mg/ml 24 óra 43 óra 66 óra 55 0 5,80 _ 5,80 _ 10 191 540 231 5,25 268 20 192 5,40 270 5,25 301 30 246 5,35 334 5,15 390 60 0 0,7 5,75 1,5 5,80 2,1 10 200 5 10 243 4,70 270 4
