181413. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóztartalmú szacharid készítmény előállítására
5 181413 6 3. az 1. lépésben kapott poliszacharidot izomeráz enzim távollétében fruktóztartalmú termékké hidrolizáljuk. A szekunder szubsztrát nagy mennyiségű glükózt és kismennyiségü fruktózt tartalmazó monoszacharid-frakcióból és legalább 60 súly% fruktozil-gyököt tartalmazó poliszacharidokból áll. A szekunder szubsztrát poliszacharidjai mind fruktóztartalmú polimerek (szacharóztól eltérőek), amelyek két vagy több monoszacharid-gyököt tartalmaznak. Ezekre a polimerekre továbbá még az jellemző, hogy (2->l)-ß kötésekkel kapcsolódó fruktozil-gyököket tartalmazó poliszacharidokból állnak. Amint a későbbiekben leírjuk, az adott körülmények közt végbemenő transzfruktozilezésből származó poljszacharidok túlnyomórészt előre meghatározott tartományon belül lehetnek. így például olyan szekunder szubsztrát termelődhet, amelyben a poliszacharid legnagyobb része (azaz legalább 60 mól%-a) 2—10 monoszacharid-gyököt (DP 2—10), vagy inkább 3—6 mónoszacharid-gyököt (DP 3—6) tartalmazó oligomer. Ezután az említett glükóz (izomeráz enzim hatására) fruktózzá izomerizálódik az említett poliszacharidök jelenlétében, majd ezt követi az említett poliszacharidok hidrolízise aktív izomeráz enzim távollétében. A hidrolízist végezhetjük enzimatikusan invertáz alkalmazásával vagy savval enyhe körülmények között. A találmány szerinti eljárás egy másik foganatosítási módja szerint a poliszacharidokat elválasztjuk a glükóztól és fruktóztól, majd ezt követően az előbb leírtak szerint hidrolizáljuk, így a szekunder szubsztrátból a szubsztrátban lévő dextróz izomerizálásának szükségessége nélkül közvetlenül nagyon nagy fruktóztartalmú szirupot kapunk, azaz 60 súly%-nál és előnyösen 90 súly%-nál magasabb fruktóztartalmút. Ilyen elválasztás a molekulanagyságon alapuló szokásos fizikai elválasztási technikákkal hajtható végre, például a szokásos membrános technológiával (ultraszüréssel, dialízissel), oldószeres kicsapással, szenes abszorpcióval és hasonlókkal. Membrános technológiákra a 3 173 867. számú, Re 26097. számú, 3 541 006. számú és 3 691 068. számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban találunk példákat. A nagy fruktóztartalmú szirupok előállítására szolgáló eljárás egyik előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy a szacharózt olyan fruktozil-transzferáz enzimkészítmény hatásának teszünk ki, amely például Pullularia pullulans törzsekből, így ATCC 9348, ATCC 12 535, NRRL 1673, NRRL Y2311, NRRL YB 3892, NRRL YB3861, NRRL 3937 és ATCC 15 223 törzsekből származik. A keletkezett terméket vagy szekunder szubsztrátot izomeráz enzim hatásának vetjük alá. Ezután az izomerizált terméket aktív izomeráz enzim távollétében hidrolizáljuk. A találmány szerinti eljárással előállított szekunder szubsztrát véleményünk szerint új anyag. Ez a szubsztrát egyedülálló módon alkalmas izomerizálásra és ezt követő hidrolízisre, így 55%-nál nagyobb fruktóztartalmú szirupot eredményezve, és úgy állítható elő, hogy szacharózt fruktozil-transzferáz enzimkészítmény hatásának vetünk alá. A találmány szerinti eljárással enzimatikus izomerizálásra és ezt követő, 55%-nál több fruktózt tartalmazó sziruppá történő hidrolízisre alkalmas szubsztrátot nyerünk, amely (1) körülbelül 20—60 súly% monoszacharidot tartalmaz, amelynek nagy része glükóz, kisebb része fruktóz, és (2) körülbelül 70 —40% poliszacharidot, amely több mint 60 súly%-nyi fruktozil-gyökből áll. Különösen előnyösek a szacharózból hatásos mennyiségű Pullaria pullulans ATCC 9348 törzsből származó fruktoziltranszferáz enzimkészítmény jelenlétében, körülbelül 25 °C-tól körülbelül 65°C-ig, előnyösen körülbelül 50 °C-tól 60 °C-ig terjedő hőfoktartományban, és körülbelül 4,5—6,5, előnyösen körülbelül 5,4—5,6 pH-n végzett transzfruktozilezéssel kapott szekunder szubsztrátok. A kiindulásnál alkalmazott szacharózkoncentráció legalább 10g/100ml víz. Előnyös azonban, ha a lehető legmagasabb szárazanyagtartalomnak megfelelő koncentrációt alkalmazunk, előnyösen körülbelül 30—60 g szacharóz/100 ml víz koncentrációtól (maximális reakciósebesség) a szacharóz telítési pontjáig (és magasabbat, amint később bővebben leírjuk). Egy gramm szacharóz legalább 0,5 egység fruktoziltranszferáz enzim használandó a találmány szerinti új szubsztrát előállításához. Gazdaságossági megfontolásokból általában az enzim mennyisége nem haladja meg az 50 egységet egy gramm szacharózra számítva. Gazdaságosság szempontjából előnyös, ha egy gramm szacharózra számítva körülbelül 2—30 egységnyi enzimet használunk. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban bővebben ismertetjük. A fruktozil-transzferáz termelésére szolgáló eljárás során a szokásos fermentációs technikát alkalmazhatjuk [lásd például a 3 565 756. sz.; 3 806 419. sz.; 3 535 123. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokat és S. Ueda és misai, közleményét: Applied Microbiology, 11, 211—215. (1963)]. Előnyösen olyan új elválasztási és tisztítási eljárásokat alkalmaztunk, amelyeket részletesebben az alábbiakban írunk le. A következő példa tipikus fermentációs eljárás a Pullularia pullulans ATCC 9348-ból származó enzim előállítására. 1. példa Celit hordozóra kötött fruktozil-transzferáz enzimkészítmény előállítása. A) Az enzim termelésére használt fermentációs eljárás. Az inokulumtenyésztéshez és az enzimtermelő fermentáláshoz a következő táptalajt használjuk: 0,5% dikálium-hidrogén-foszfát, 0,1% nátrium-klorid, 0,02% magnézium-szulfát-heptahidrát, 0,06% ammónium-szulfát, 0,3% élesztő extraktum (Difco), 7,5% szacharóz (élelmiszer minőségű), a táptalaj pH-ját 6,8-ra állítjuk be. A 100 ml steril táptalajt tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombik oltópalackokat a Pullularia pullulans fekete élesztő ferde tenyészetéről oltjuk be. A használt élesztőtörzset az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) katalógusában ATCC 9348 jelzéssel illetik. A rázóasztalon 48 órán át 32 °C-on inkubált oltópalackokat használjuk az egyliteres Erlenmeyer lombik fermentálópalackok inokulálására, amelyek mindegyike 200 ml előbb megadott táptalajt tartalmaz. Az alkalmazott inokulum-koncentráció 0,5% (súly/térf.). A fermentációt rázóasztalon 32 °C-on 7 napig folytatjuk. B) Az enzim kinyerése a fermentléből. ötven darab egyliteres fermentáló palackból összeöntjük a fermentlevet, a palackokat vízzel átöblítjük, amit szintén hozzáadunk az egyesített fermentléhez. A fermentlé végtérfogata hígítás után 12 liter. A fermentlé eredeti térfogata körülbelül 8 liter. A 12 liter fermentléből Sharpies folytonos centrifugán átengedve eltávolítjuk az élesztősejteket és a sejttörmeléket. A fekete viszkózus felülúszóhoz 0,5% koncentráció eléréséig adunk kalcium-kloridot, és a kapott oldat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
