181413. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fruktóztartalmú szacharid készítmény előállítására
3 181413 4 a találmány leírása során ezen monoszacharid bármely — oldatban lévő vagy száraz — formájának megnevezésére. Az „enzimkészítmény” kifejezés az itt használt értelemben bármely olyan készítményre vonatkozik, amely a kívánt enzimatikus hatással rendelkezik. Ezt az elnevezést használjuk például élő teljes sejtek, száraz sejtek, sejtkivonatok, a sejtekből és tenyészfolyadékokból származó tisztított és koncentrált készítmények megnevezésére. Az enzimkészítményeket a találmány során a gyakorlatban oldatban vagy kötött formában használjuk. A leírás során „izomeráz enzim” néven említünk minden olyan enzimkészítményt, amely dextrózt levulózzá izomerizál. Ezek az enzimek a szakterületen jól ismertek, és dextróz izomeráz, xilóz izomeráz és glükóz izomeráz néven említik őket. Ilyen enzimek számos alkalmas mikroorganizmusból származhatnak. Ilyen mikroorganizmusok például a Streptomyces, Bacillus, Arthrobacter, Actinoplanes, Curtobacterium és egyéb törzsekhez tartoznak. A jelen találmány során használt előnyös izomeráz enzim Streptomyces olivochromogenes ATCC No. 21 713, ATCC No. 21 714vagy ATCC No. 21 715 törzsekből származik (az utóbbi az ATCC No. 21 713 különálló telepe), ahogy a 3 813 318. sz. és 3 957 587. sz. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírásokban közzétettük, főként ha a 3 770 589. sz. vagy 3 813 318. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban leírt eljárás szerint készült. A szakirodalomban jelenleg közölnek olyan eljárásokat, ahol az izomeráz enzimet vízben oldhatatlan iners hordozóra kötik. A kötött enzim utána alkalmas glükóznak nagy fruktóztartalmú sziruppá történő folyamatos átalakítására. Ilyen eljárásokra a 3 708 397.; 3 788 945.; 3 850 751.; 3 868 304. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásokban, a 819 859. sz. belga szabadalmi leírásban és a 3 960 663. sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban (810 480. sz. belga szabadalmi leírás) közölnek példákat. „Izomeráz egység” az enzimaktivitás mértékegysége, az az enzimmennyiség, amely percenként egy mikromól levulóz termeléséhez szükséges az izomeráz enzim aktivitás meghatározásánál alább leírt körülmények között. Izomeráz aktivitás meghatározás fogalma az itt használt értelemben arra a meghatározási eljárásra vonatkozik, amelynek lényege a glükózoldatból állandósított körülmények között termelődő ketóz spektrofotometriás meghatározása. A meghatározáshoz a következő törzsoldatot készítjük: 0,1 mólos MgS04 • 7H20 oldat 1 ml, 0,001 mólos CoCl2 • 6H20 oldat 1 ml, 1 mólos 7,5 pH-jú nátrium-foszfát puffer 0,5 ml, vízmentes D-glükóz 1,44 g. Desztillált vízzel 7,5 ml össztérfogatra feltöltjük. A meghatározandó enzimkészítményt először körülbelül 1—6 izomeráz egység/ml koncentrációra hígítjuk. Az enzimes izomerizációt úgy végezzük, hogy 1 ml enzimkészítményt adunk 3 ml törzsoldathoz, és 60 °C-on 30 percig inkubáljuk. Az inkubációs periódus végén 1 ml aliquotot kiveszünk, és 9 ml 0,5 n perklórsavba öntjük. Ezt az oldatot azután 250 ml végtérfogatra hígítjuk. Kontrollként, összehasonlító célokra, glükóz vakpróbát készítünk, 1 ml enzim helyett 1 ml vizet adva az oldathoz az inkubálási periódus kezdetén. A ketózt azután cisztein-kénsav módszerrel határozzuk meg. A jelen meghatározás esetében az izomeráz egységet úgy definiáljuk, mint azt az enzimaktivitást, amely percenként egy mikromól levulóz termeléséhez szükséges a leírt izomerizációs körülmények között. A „transzfruktozilezés” az itt használt értelemben egy fruktozil-gyöknek a donorról, például szacharózról, egy akceptorra, például poliszacharidra történő átvitelét jelenti. A fruktozil transzferáz enzimen olyan enzimet értünk, amely katalizálja a transzfruktozilezést. Ilyen például a Pullularia pullulans ATCC 9348-ból (azonos az Aureobasidium pullulans-sal) származó enzimkészítmény. Az itt használt értelemben a fruktozil transzferáz egységet úgy definiáljuk, mint azt az enzimaktivitás-mennyiséget, amely percenként egy mikromól glükózban számított redukáló cukor előállításához szükséges a következő feltételek mellett: a) pH=5,5; b) hőmérséklet: 55 °C; c) szubsztrátkoncentráció: 100 ml vizes reakcióelegyben 60 g étkezési minőségű szacharóz. A redukáló cukor meghatározást (glükózra számolva) „Technicon Autoanalyzer II” (Technicon Inc., Tarrytown, New York) alkalmazásával végeztük. Az analízist a szokásos lúgos ferricianid módszenei végeztük [Analitical Biochemistry, 45, (2), 517—524 (1972)], amelyet az „Autoanalyzer II”-höz igazítottunk. Ha másképp nem jelezzük, akkor az enzimaktivitás-meghatározásokat az alábbi összetételű reakcióelegy folytonos megfigyelésével végezzük: 7,5 ml 80%-os élelmiszer minőségű vizes szacharóz oldat, 2,3 ml 0,1 mólos 5,5 pH-jú citrátpuffer, 0. 2.ml enzim minta, amely olyan mennyiségű fruktoziltranszferáz enzimet tartalmaz, amely a reakcióelegy 1 ml-nyi mennyiségéből percenként 5—25 mikrogramm redukáló cukrot termel (glükózra számolva). A „primer szubsztrát” kifejezés az itt használt értelemben olyan szacharidokra vonatkozik, amelyek transzfruktozilezésben való részvételre alkalmasak és hozzáférhető fruktozil gyököt tartalmaznak, mint például szacharóz vizes oldatai. A „szekunder szubsztrát” kifejezés az itt használt értelemben a fruktozil-transzferáz enzimkészítmény hatásának kitett primer szubsztrátból keletkező reakciótennéket jelenti. A találmány leírása során a rész kifejezés mindig súlyrészt jelent és a százalék kifejezés mindig vegyes százalékot (súly/ térfogat) jelent, ha másképp nem jelöljük. A „nagynyomású folyadékkromatográfiás meghatározás” kifejezés itt azt az eljárást jelenti, amelynek során a találmány szerinti eljárással előállított szirupokat nagynyomású folyadékkromatográfiával analizáljuk a következő technikával. A komponenseket kalcium-formában lévő kationcserélő gyantáról vízzel eluálva kromatografáljuk. Az eluált komponenseket differenciál-refraktométer segítségével detektáljuk. A nem-dextróz jellegű szénhidrátok mennyiségét elektronikus integrátorral határozzuk meg, és a dextrózt különbségként kapjuk meg. Az általános eljárást a „Szénhidrát-elegyek analízise folyadékkromatográfiával” c. közlemény [Am. Soc. Brew. Chem. Proc., 43—46 (1973)] adja meg. Az alkalmazott gyanta kalcium-formájú „Aminex Q” 15-5 gyanta, a Bio Rád Laboratories, Richmond, California készítménye. A találmány értelmében tehát fruktóztartalmú szacharid készítményt állítunk elő szacharóz (primer szubsztrát) dextrózból, fruktózból és poliszacharidokból álló szacharid készítménnyé (szekunder szubsztrát) való átalakítása a dextróz fruktózzá történő izomerizálása és a poliszacharidok hidrolízise útján oly módon, hogy 1. szacharózt 25—60 °C hőmérsékleten és 4,5—6,5 pH- értéken fruktozil-transzferáz enzimmel kezelve dextrózból, fruktózból és legalább 60 súly% fruktozil gyököt tartalmazó poliszacharidokból álló szacharid készítményt állítunk elő, ahol a fruktozil gyökök (2-lekötésekkel kapcsolódnak, 2. a szacharid készítményben levő dextróz egy részét izomeráz enzimmel fruktózzá izomerizáljuk és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
