181238. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a di-O-(n-hosszúszénlánú-alkil-vagy-alkenil)-propándiolok amin-származékának előállítására
11 1812)8 12 A találmány szerinti vegyületek in vitro hatása a humán polipsejtek vírushozamának csökkentésére Eagle minimál táptalajának 100 ml-ét 2 ml 100-szorosan tömény antibiotikum-antifungális oldattal, 1 ml 200 mM-os glutamin-oldattal, 1 ml 100-szoros töménységű, nem eszenciális aminosav-oldattal, Imi 10 mM-os nátriumpiruvát-oldattal és 10%, hővel inaktivált polipszérummal kiegészítve táptalajt készítünk. 96 helyes mikrotiter lemezeket körülbelül 50 000, 0,2 ml táptalajba szuszpendált humán nazális polipsejttel oltunk be, 8—10 napon át 37 °C hőmérsékleten és 5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáljuk a lemezeket az egyrétegű sejtkultúra előállítására. A 8-10. nap végén a lemezeken összefüggő egyrétegű sejt fejlődik ki, amelyeket 4-szeres foszfát puffert tartalmazó sóoldattal mosunk, majd közvetlenül ezután helyenként 0,2 ml, a példa szerinti vegyületből 10, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 és O/ug/ml-t tartalmazó 0,2 ml térfogatú fenntartó táptalajjal kezelünk. A fenntartó táptalaj összetétele azonos a növesztést biztosító táptalaj összetételével, azzal a különbséggel, hogy a borjúszérumból 2%-ot tartalmaz. További 18 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészeteket, majd 4-szeres foszfát puffert tartalmazó sóoldattal mossuk az egyrétegű sejttömeget a hatóanyag eltávolítására. Ezt követően vezikuláris sztomatitisz vírussal (VSV) két órán át 37 °C hőmérsékleten fertőzzük a sejttenyészetet, a vírusmennyiséget a TCIDso -érték 1000-szeresére állítjuk be (a TCIDS0-érték a nem védett sejttenyészetben 50%-os fertőzést okoz). Az adszorpciós szakasz lejárta után 4-szeres foszfát puffert tartalmazó sóoldattal mosva eltávolítjuk a nem adszorbeálódott vírusrészecskéket, majd ismét 0,2 ml fenntartó táptalajt töltünk a lyukakba. Ezután 7 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a lemezeket, majd mindegyik lemezről 5-8 replika-sejt tenyészlevét összegyűjtjük, fagyasztva tároljuk, és végül az L-929 egér fibroblaszt lemezeken meghatározzuk a fertőző vírusok számát. Az L-929 egér fibroblaszt sejttenyészeteket mikroszkopikusan vizsgáljuk, és 3-4 nappal később analizáljuk az adatokat. Az eredményeket a 3. táblázatban adjuk meg, öt hatóanyag-koncentrációra vonatkoztatva. 3. táblázat 9-12. példa A példa száma Az adott példában előállított vegyület A vírushozam %-os csökkenése3 10 koncentráció (Mg/ml) 5,0 1,0 0,5 0,1 9. 1. + ± _ _ NM 10. 2. + + NM 11. 3. +-1- - -NM 12. 4. + — — — NM (a) + = > 68%-os redukció, ± = ~ 68%-os redukció, — = < 68%-os redukció, NM = nincs meghatározva. 13. példa Az 1 -[2,3-di-0-(n-hexadecil)-oxi-propil]-4- -amino-metil-4-fenil-piperidin-dihidroklorid képessége a cirkuláló interferon indulálására Azonos mennyiségű l-[2,3-di-0-(n-hexadecil)-oxi-propil]-metil-4-fenil-piperidin-dihidrogénkloridot, poliszorbát 80-at és glicerint keverünk, majd 0,14 mólos, 0,01 mól pH 7-es nátriumfoszfátot tartalmazó forró nátriumkloridban homogenizáljuk a keveréket. Az így kapott olaj-vízben emulziót a fenti nátriumklorid-nátriumfoszfátos eleggyel hígítjuk adagolás előtt. Nőstény 20-25 g testsúlyú Swiss egereket intraperitoneálisan 0,5 ml, a fentiek szerint hígított emulzióval oltunk be, amely 25 mg/testsúlykilogramm hatóanyagot tartalmaz. Az injekciót követő 8., 12., 16. és 20. órában plazmamintát veszünk 4 egérből és összegyűjtjük a mintákat. L-15 (Leibovitz) táptalajjal, amelyet 5% boíjú-szérummal egészítettünk ki, sorozathígításokat készítünk, majd mikrotiter lemezeken inkubáljuk őket egy éjszakán át, 37 °C hőmérsékleten, összefüggő L—929 egér fibroplasztokból álló sejtrétegen. Ezután fehérje-mentes oldattal mossuk az egyrétegű sejttömeget, majd a TC1D50-érték (az a vírusmennyiség, amely a nem védett tenyészetekben 50%-os fertőzést okoz) 10-szeresének megfelelő vezikuláris sztomatitisz vírussal (VSV) fertőzzük a sejttenyészetet. Egy órán át 37 °C-on tartjuk a fertőzött tenyészetet, mialatt megtörténik az adszorpció. Ezután mossuk a tenyészetet, 5% boíjúszérumot tartalmazó L-15 táptalajjal kezeljük, majd további 48 órán át 37 °C-on inkubálunk. Ezután a vírus okozta citopatológjás elváltozásokat az L-929 sejtek mikroszkópos vizsgálatával állapítjuk meg. Meghatározzuk a plazma interferon-tartalmát oly módon, hogy az L-929 egyrétegű sejttenyészet 50%-os védettségét biztosító plazma-hígítás reciprokát vesszük. A fenti kísérletet megismételjük azzal a különbséggel, hogy az egereknek 10 mg/testsúlykilogramm l-[2,3-di-0-(n-hexadecil)-oxi-propil]-amino-metil-4-fenil- piperidin-dihidrogénkloridot adunk, és 4 egérből peritoneális mosófolyadék mintáit gyűjtjük össze az injekciót követő 6., 9., 12., 15. és 18. órában. A peritoneális membránnal érintkező mintákat oly módon vesszük, hogy a peritoneális üregbe milliliterenként 100 E penicillint és 100 jug sztreptomicint tartalmazó Hank-sóoldatot injektálunk (1 ml), rövid ideig nyomkodjuk a hasüreget, majd ezt követően lecsapoljuk a peritoneális mosófolyadékot. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
