181104. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 41200 RP jelű, immunitást fokozó anyag előállítására
181104 4 C = 41,5-44,9%, H = 5,6-5,9%, O = 29,4-32,2%, N = 11,2-12,6%, P = 3,2—4,4%, S = 0,1-0,5%, Cl = 0,2—0,4%, kénsavas hamvaszt ássál kapott hamuja 11,4—15,4%. A nyers terméket literenként 10—40 g, előnyösen literenként 20 g koncentrációjú vizes oldatként tisztítjuk oly módon, hogy addig adunk hozzá tömény kalciumklorid oldatot, amíg végső kalciumklorid koncentrációként literenként 5—50 g-ot, előnyösen literenként 10 g-ot nem érünk el. A keletkezett csapadékot centrifugálással távolítjuk el, és a kapott oldatot dializáljuk (vagy ultraszűrjük), majd alkálikus alakban levő, szulfonsavcsoportot tartalmazó ioncserélő gyantán vezetjük át. A kapott, 32919 RP névvel jelölt terméket vizes oldatából liofilizálással nyerjük ki. A 32919 RP elnevezésű termék lényegileg 24—33% aminosavat, 26—33% nukleinsavat, 11-17,5% aminocukrot (Elson-Morgan féle módszerrel meghatározva, és az eredményeket glükózaminként fejezve ki), 2,8—4,3% poliszacharidot tartalmaz, és elemi összetétele a következő: C = 44-48%, H = 5,2-6,7%, O = 29-33%, N = 10,11,6%, P = 2,3-3,7%, S = 0,5%-nál kevesebb, Na = 3,0—3,8%, Ca = 0,15—0,50%. A 32919 RP jelű terméket a következő módon tisztítjuk tovább: Literenként 10—50 g, előnyösen literenként 25 g 32919 RP jelű terméket tartalmazó, vizes oldatot azonos térfogatú fenol-víz eleggyel (előnyösen 10% vizet tartalmaz) 15—60 percig, előnyösen 30 percig 65 °C körüli hőmérsékleten mossuk. Lehűlése után a vizes fázist elválasztjuk, és klórozott szénhidrogén nel, előnyösen kloroformmal az oldott fenol teljes eltávolításáig mossuk, majd desztillált vízzel szemben dializáljuk. A hatóanyagot tartalmazó vizes fázist liofilizáljuk. Az így kapott terméket alkáliacetáttal, például nátriumacetáttal 7 pH-ra pufferolt vízben feloldjuk, és az oldatot nagy porozitású molekulaszűrőn, például az Industrie Biologique Française „Ultragel Ac A 22” termékén vagy a Société Pharmacia „Sepharose 4B” vagy „Sepharose CL 4B” termékén frakcionáljuk és a nagy molekulájú frakciókat összegyűjtjük. Ezután a 41 200 RP jelű terméket oldatából ionmentesített vízzel szemben való dializálás után liofilizálással nyeljük ki. A Micrococcus sedogenes M 78 törzset, amelynek tenyészetét alkalmas körülmények között a 41200 RP előállítására használt sejteket szolgáltatja, a Micrococcus nembe tartozó új fajnak tekinthetjük. Ezt a törzset Brazíliából származó talajmintából a mikroorganizmusok izolálására általánosan használt módszerek szerint különítettük el. Ennek a törzsnek egy mintáját az amerikai egyesült államokbeli Department of Agriculture, Peoria, Dl. Northern Regional Research Laboratory laboratóriumban letétbe helyeztük, és itt 1968. augusztus 14-én NRRL B—3505 számon lajstromozták. .1 Ez a laboratórium felhatalmazást nyert arra, hogy ezt a törzset minden olyan személynek rendelkezésre bocsájtsa, aki megengedetten szerzett tudomást erről a szabadalmi bejelentésről. Ennek a mikroorganizmusnak jellemző tulajdonságait a „Manual of Microbiological Methods” [Society of American Bactriologists, Me. Graw-Hill Book Company, New York (1957)] kézikönyvben, valamint J. Dumas: „Bactériologie Médicale” [Editions Medicales, Flammarion, Paris (1951)]; Lambin S. és A. German: „Précis de Microbiologie” [Collection des Précis de Pharmacie, Masson, Paris (1961)]; H. Cassagne: „Milieux de culture” [Edition de la Tourelle, Paris (1961)]; Skerman: „Guide to the identification if the Genera of Bacteria” [The Williams and Wilicins Company, Baltimore (1967)] művekben ismertetett különféle azonosítási módszereknek megfelelően határoztuk meg. A nem meghatározását a „Bergey’s Manual of Determinative Bacterology” [7. kiadás, The Williams and Wilkins Company, Baltimore (1957)] azonosítási módszer alapján végeztük. Az M 78 törzs morfológiai tulajdonságait 26 °C-on, 24 óra hosszat sztatikusan tenyésztett telepeken tanulmányoztuk. Ezeket a tenyészeteket gömb alakú Gram-pozitív, nem saválló, mozdulatlan, 1-1,3 mikron átmérőjű sejtek elkülönülten vagy kettes vagy négyes csoportokba vagy 4-16 sejtből álló láncocskákká vagy 20-50 sejtből álló szabálytalan csoporttá tömörülten alakítják. Spórák jelenlétét nem figyeltük meg. A ferde agaron kialakult telepek bőséges nyálkás, sima vagy nagyon kevéssé ráncos, szagtalan, pigmentet nem termelő, lágy konzisztenciájú bevonatot képeznek. A Petri-csészében lévő agar-táptalajon a tenyészet szabályos szélű, sima felületű, kör alakú telepeket alkot; ezek a telepek laposak vagy csak kissé domborúak, és többé-kevésbé átlátszatlanok. A glükóztartalmú húsfőzet folyékony táptalajon a tenyészet mérsékelten zavaros, pigmentmentes, szagtalan, pelyhes üledékkel. Burgonyán tenyésztve az M78 törzs nyálkás, sima, nagyon halvány, sárgásfehér bevonatot alkot anélkül, hogy a burgonyát megfeketítené, vagy oldható pigmentet termelne. A biokémiai tulajdonságokat 26 °C-on inkubált tenyészeteken vizsgáltuk. A megfigyelt tulajdonságokat a következőkben összegezzük: Légzés típusa: szigorúan aerób. Nitrit és nitrát redukálás: pozitív. Pigmentképzés: negatív. Indoltermelés: negatív. Kénhidrogén-termelés: negatív. Zselatin elfolyósítás: 21 napig negatív. Kazein-hidrolízis: pozitív. Metilvörös-próba: negatív. Acetil-metil-karbinol vizsgálat (Voges— —Proskauer reakció): negatív. Tenyésztés lefölözött tejen: nincs koagulálás. nincs peptonizálás; az 1. és 21. nap között a közeg pH-értéke 6,1-ről 7,5-re változik. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
