180920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy rosttartalmú anyagok feltárására alkalmas cellulóz enzim-készítmény előállítására
5 180920 6 nyílást visel, külső, felső felszínét sötétbarna, spirális el nem ágazó 400—500 /,< hosszú, érdes felszínű díszítő fonalak borítják. A peritéciumban bazálisan 30—50 db. bunkó alakú, 30—50 u hosszú aszkusz helyezkedik el. Ezek egysejtűek, tojásdadok, két végükön kissé hegyesek, barna színűek, 8—9,5x6—7,5 /u méretűek. Kukoricaliszt agaron a telepek világosabbak, lassabban nőnek, a termőtestek a micéliumnál nagyobbak. Tulajdonságai alapján a törzs a Chaetomicae családba, a Chaetomium globosum Kunze fajtába sorolható (Ames, L. M. : A monograph of the Chaetomiaceae. U. S. Army Res Develop Series No. 2. 1961.) Az említett mikroorganizmusokat inokulumkészítésre használjuk, de szükség lehet a törzsfenntartásra, különösen akkor, ha a szelekció kisebb kapacitással vagy más helyen vagy időben folyik, mint az inokulum-készítés. A törzsfenntartás megoldható bármilyen ismert módszerrel,. például liofilizálással, gabonafélék sterilizált magjaira való fel vitettél vagy más alkalmas módon. Legelőnyösebbnek azonban azt a megoldást találtuk, hogy a szelekált mikroorganizmusokat olyan szilárd táptalajra visszük, amely egyedüli szénforrásként az inokulum és termő táptalajnál leírtakhoz hasonlóan valamely cellulóztartalmú természetes anyagot tartalmaz. Cellulóztartalmú természetes anyagként az eddig leírt és ezután részletezendő műveletekben célszerűen kukoricanövény lisztet (a tejes érés kezdetétől az érés végéig termesztett és megszárított növény őrleményét), kukoricacsutka-őrleményt, búzakorpát, lucernalisztet, csillagfürt növénylisztet használunk. A szárított lucemaliszt és csillagfürtliszt különösen előnyös, mert ha ezt használjuk szénforrásként, akkor külön szerves nitrogénforrásra már nincs szükség. A szelektált mikroorganizmusokat ezután olyan táptalajra oltjuk, amely egyedüli szénforrásként egy előbb meghatározott cellulóztartalmú természetes-anyagot tartalmaz 0,5—5,0 súly/ térf. %, előnyösen 2,0 súly/térf. % mennyiségben. A tápközeghez szerves nitrogénforrásként előnyösen kukoricalekvárt adunk, azonkívül kiegészítjük a tápközeget szervetlen nitrogénforrással és egyéb szervetlen sókkal. Vizsgálataink szerint előnyös, ha nitrátmentes szervetlen nitrogénforrást használunk. A mikroorganizmusokat 1 evegőztetés és keverés közben 27—32 °C- on tenyésztjük 24—30 órán át. Ezalatt a pH értéke a kezdeti 7,0-ról 6,5—6,0-ra csökken, és erős, vastagszálú micélium fejlődik, amely sűrűn benövi a táptalajt. Az így kapott inokulumot a termelő táptalajra oltjuk annak térfogatára számítva 5—15%, előnyösen 10% mennyiségben. A fermentációhoz olyan táptalajt használunk, amely egyedüli szénforrásként cellulóztartalmú természetes anyagot tartalmaz 5—10 súly/térf. %-ban, előnyösen 6 súly/térf. %-ban. Szénforrásként előnyösen a fent felsorolt anyagokat használjuk, A fermentációhoz használt táptalaj szervetlen nitrogénforrásként célszerűen 0,1— 0,5 súly/térf. %, előnyösen 0,2 súly/térf. % ammóniumszulfátot és/vagy ammoniumfoszfátot tartalmaz. Szerves nitrogénforrásként nővénj i fehérjét és/vagy kukoricalekvárt adunk a táptalajhoz célszerűen 0,2—3,0 súly/térf. % menynyiségben. A fermentációt 70—96 órán át folytatjuk a szubmerz rendszerben levegőztetés és keverés mellett. A fermentáció hőmérséklete célszerűen 26—37 °C. A fentiek szerint végzett fermentáció után olyan fermentlevet kapunk, amelyben a celluláz enzim aktivitása Cx =800—1000 E/ml, ill. Cj = 10 000—12 000 E/ml. A fermentáció befejezésével a fermentlevet ismert módon élesre szűrjük, majd betöményítjük. A betöményítést végezhetjük ultraszűréssel, és/vagy vákuumbepárló berendezéssel. Méréseink szerint azt találtuk, hogy a fermentlé a szokásos módon csiak jelentős enzimaktivitás veszteséggel sűríthető, ezért az élesre szűrt fermentlevet célszerűen egy fordított ozmózis elvén működő berendezésen töményítjük be és tisztítjuk. A művelet során a kis molekulasúlyú anyagok az enzimolból a vízzel, a szelektív membránon keresztül kiszorulnak, miközben a nagy molekulasúlyú enzimoldat koncentrálódik és tisztul. A sűrítrítményt tartósítjuk. A sűrítményhez 0,1—6,0%, előnyösen 3,0% vízoldható vívőanyagot, célszerűen valamilyen polihidroxi- vagy polikarboxivegyületet, előnyösen karboximetilkeményítőt, polivinil-pirrolidont, karboximetilcellulózt adunk. Ezek az anyagok védik az enzimmolekulát a hőkárosodástól. Az enzimsűrítményt ezután alacsony hőmérséklten, max. 40 °C-on ismert módon megszárítjuk, amikoris poralakú terméket kapunk. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa Az enzimtermelésre kiválasztott Helminthosporium sativum H/52, (MNG 00188 dep. sz.) törzset 1,0% kukoricacsutkaőrleményt tartalmazó, Czapek-Dox sóalappal beállított agaron szelektáljuk és tartjuk fenn. Az egy hetes tenyészet felületéről lemosott micéliumtömeget fiziológiás sóoldattal szuszpendáljuk, A szuszpenzió 100 miével oltjuk a lesterilezett 70 liter inokulum táptalajt, amelynek összetétele: búzakorpa 2,0 % kukoricalekvár (por) 0,25 % KH2PO4 0,1 % Na2HP04. 12 H20 0,1 % (NH4)2S04 0,2 % KC1 0,05 % MgS04.7 H20 0,05 % FeS04.7 H20 0,001% napraforgóolaj 0,5 % pH=7,0 5 10 15 2C 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
