180920. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagy rosttartalmú anyagok feltárására alkalmas cellulóz enzim-készítmény előállítására
3 180920 4 írás szerint oly módon állítanak elő ccüuláz enzimet fermentációs úton, hogy cukrot és cellulózport tartalmazó táptalajon Lampteromycetes japanicus mikroorganizmus törzset, ill. különféle Fomitopsis törzseket tenyésztenek. A módszer hátránya, hogy a fermentációs idő meglehetősen hosszú, minegy 5—10 nap. Az így előállított enzim aktivitása szintén meglehetősen csekély. A 3 398 055 számú USA-beli szabadalmi leírás szintén aerob szubmerz fermentációs eljárást ismertet, amellyel természetes cellulózforrást tartalmazó táptalajon termelnek celiuláz enzimet. Az inokulumot bonyolult úton, 4 lépésben állíjták elő. Az első három szakasz 2—7 napig, a negyedik 104 óráig tart. Az így kapott inokuíumot oltják az említett táptalajra, amelyhez cukrot is adnak. A kapott fermentlét gyapotra adszorbeálják, majd eluálják, bepárolják és liofilizálják. A módszer hátránya, hogy az inokulum-készítés bonyolult, a fermentációs idő hcszszú (kb. 140 óra), és a fermentlé feldolgozása bonyolult technológiát követel. Az így kapott enzim aktivitása mindössze 12,5 E/ml. ZELTIN, R. P. és munkatársai (Mikrobiológiája 39. 382. 1970 és Biossintez célluloliticseszkij fermentov gribom Aspergillus terms 17P pri kultivirovannüj ivó v poluproizvidsztvennúh uszlovijah, Ferrnentacija. Izdatelsztvo zinatnye Riga 1974. p. 5—10). Aspergillus terreussal végeztek celiuláz fermentációt. Szalmát, búzakorpát, fűrészport és tőzeget használtak szénforrásként, a szervetlen nitrogént NaNO;t-tal biztosították. Legmegfelelőbbnek a búzaszalmát találták háromnapos fermentáció után. Az így előállított enzim aktivitása gyenge, C| = 0,49 E/ml és C =12,0 E/ml. A nemzetközi szakirodalom szerint az enzimaktivitást a cellulózt elcukrosító Ci és cellulózt elfolyósító Cx enzimkomponens aktivitása alapján határozzák meg. A C| aktivitást MN 300 cellulóz por (Macherey Nagel) szubsztrált 0,5%-os szuszpenzl ójának pH=5,0 értéken 40 °C hőmérsékleten, 4 órás enzimes kezeié után nyert glükóz //g-ban kifejezett mennyiségével mérjük. Egységnyi az az enzimaktivitás, amely a fenti körülmények között 1 Mg glükózzal egyenétrtékű redukáló anyagot tesz szabaddá. 1 Cx aktivitású az az enzim-mennyiség, amely 0,5%-os Tylose 600 (Hoechst cég) oldatot 20 perc alatt, 40 °C-on 50%-ban elbont, vagyis az oldat speciális viszkozitását az indulási érték felére csökkenti. A találmány célja, hogy olyan eljárást biztosítson, amellyel nagy rosttartalmú anyagok feltárására alkalmas, nagy enzimaktivitású celiuláz enzim-készítményt állíthatunk elő egyszerű módon. Azt tapasztaltuk, hogy a fenti célt elérhetjük, ha az Országos Közegészségügyi Intézetnél MNG 00188 számon letétbe helyezett Helminthosporium sativum H/52 törzsből vagy az MNG 00189 számon letétbe helyezett Chaetomium globosum CH/78 törzsből egyedüli szénforrásként 0,5—5,0 súly/térf. % mennyiségű cellulóz-2 tartalmú természetes anyagot, továbbá szerves nitrogénforrást, nitráttól eltérő szervetlen nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmazó tápközegben való aerob szubmerz tenyész- 5 tűssel inokulumot készítünk, a kapott inokulumot egyedüli szén forrásként 5—10 súly/térf. % mennyiségű cellulóztartalmú természetes anyagot, továbbá szerves nitrogénforrást, nitráttól eltérő szervetlen nitrogénfor- 10 ríst és szervetlen sókat tartalmazó tápközegra oltjuk, és aerob szubmerz körülmények között tenyészjük 70—96 órán át, a kapott fermentlét szűrjük, a szűrletet ultraszűréssel és/vagy vákuumbepárlással betömé- 15 nyítjük, és az így kapott enzimtartalmú terméket kívánt esetben vivőanyag jelenlétében porrá alakítjuk. A nagy rosttartalmú anyagok lebontására használható celiuláz enzim intenzív termelésére 20 alkalmasnak találtuk a Helminthosporium sativum H/52 és a Chaetomium globosum CH/78 törzseket, amelyeket az Országos Közegészségügyi Intézetben 1979. július 16-án MNG 00188 számon, illetve MNG 00189 számon letétbe he- 25 lyeztünk. A H/52 Helminthosporium sativum törzs burgonya-glükózos agaron gyorsan növekedik, 26 °C- on hat nap alatt 8 cm átmérőjű telepei sötétszürke színűek, bársonyosak, 4—5 nap után 30 gyapjasodnak. A törzs rosszul fruktifikál : micéliumban egyenletes elosztásban kevés konidiális szerkezet jön létre, szklerócium vagy más kompakt képződmény nem észlelhető. A légmicűliumot alkotó hifák 3,5—6,5 m vastagok, bar- 35 nák, sűrűn szeptáltak. A konídiumtartók nagyrészt a légmicéliumról, ritkábban a táptalajról közvetlenül erednek, méretük 100—150x4 fi, alakjukat szarcinoid fekete sejt aggregátumok alkotják, a faluk sima vagy fimoman pontozott, 40 r tkán szeptáltak, barnák. A konídiumok a konídiumtartó csúcsánál váltakozó, kalászszerű leképzéssel jönnek létre. A fejlett konidiális szerkezet 6—10 konídiumot visel. A konídiumok orsó alakúak, mindkét végük erősen lekerekí- 45 tett, vastagok, simafalúak, barnák, 4—8 sejtűek, 40—70x16—10 fi méretűek. A törzs as'zkuszt, illetve aszkospórát nem fejleszt. Jól tenyészik malátakivonat agaron, Sabouraud-glükóz agaron kukoricaliszt agaron, Csillag-féle melaszos 50 agaron, Kiming-féle agaron. A fenti tulajdonságai alapján a törzset Helminthosporium sativum P. K, et B.-nek határoztuk meg. A CH/78 Chaetomium gfobosum törzs malá- 55 takivonat agaron gyorsan növekszik, 26 °C-on 6 nap alatt 6 cm átmérőjű telepei bamásszürke színűek, a micéliumpárna 3—4 mm vastag. A törzs jól fruktifikál, a telep felülete a termő tömegétől sűrűn pontozott. A vegetatív hifák 60 2.3—2,8 /u vastgok, sárgásbarna vagy barna színűek, sűrűn szeptáltak. A termőtestek gömbölyű vagy tojásdad 250—300x200—250 fi nagyságú peritéciumok. Faluk egy-két sejtrétegű, lemezes szerkezetű, sötétbarna, néhány napos 65 korban már törékeny. A peritécium csúcsán kis
