180816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadást elősegítő készítmény előállítására emberi vérplazmából
7 180816 8 számítjuk ki. Az így kapott eredmények átlagértéke megfelel a vizsgálandó minta FEIBA-egység/ml-ben kifejezett aktivitásának. Ha ezt az értéket azután az oldat ml-ben megadott térfogatával szorozzuk, akkor megkapjuk a teljes minta FEIBA-egység tartalmát. 2. A IF VII, IX és X alvadási faktorok aktivitásának meghatározása A) A II-faktor meghatározása: a) Reagensek: Szérum: egy egészséges véradó vérét (antikoaguláns nélkül) 24 óra hosszat inkubáljuk 37 C° hőmérsékleten. A megalvadt vérből a szérumot eltávolítjuk, centrifugáljuk, adagokra osztjuk és mélyhűtve tároljuk. Oxalátos marha-plazmát bárium-szulfáton adszorbeáltatunk (az V-faktor forrásaként, valamint hígítószerként a mintákhoz): 9 rész marhavért 1 rész 1,34%-os nátrium-oxalát-oldattal elegyítünk. Az így kapott plazmát 10% bárium-szulfáton adszorbeáltatjuk. Centrifugálás után a plazmát adagonként letöltjük és mélyhűtve tároljuk. „Thromborel” kalciumtartalmú emberi tromboplasztinkészítmény, a Behringwerke AG (Marburg-Lahn) gyártmánya. b) Vizsgálati módszer: A reagenseket (amelyeket a vizsgálat folyamán a „Thromborel” kivételével jégfürdöben tartunk) a következőképpen pipettázzuk kémcsövecskékbe: 0,05 ml szérum 0,05 ml minta (sorozatos hígítások a vizsgálandó mintából illetőleg egy normális plazmából vagy egy standard plazma-készítményből) Az elegyet 37 C° hőmérsékleten 1 percig inkubáljuk, majd: 0,2 ml „Thromborel” (a vizsgálat folyamán 37 C° hőmérsékleten tartandó). A „Thromborel” hozzáadásától a megalvadásig terjedő időt stopperórával mérjük. c) A II-faktor koncentrációjának kiszámítása: Legalább 15 egészséges véradó egyesített plazmamintájából egy standard-plazmát állítunk elő. Ezt „normális plazma” gyanánt tekintjük és Il-faktor-aktivitását 100%-nak vesszük. Ezután kalibrációs görbét készítünk, oly módon, hogy az említett normális plazma hígítási sorozatát (hígítatlan, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, ...) a megfelelő koncentrációkkal állítjuk szembe kétszeres logaritmikus milliméterpapíron. A minták hígítási sorozatának Il-faktor-koncentrációját az említett kalibrációs görbe alapján, a normális plazmához viszonyított százalékokban adjuk meg és a megfelelő hígítási faktorral szorozzuk. Az így kapott eredmények átlagértéke megfelel a vizsgált minta aktivitásának, a II-faktor százalékában kifejezve. Az egy-egy üvegcsében jelenlevő II-faktor mennyiségét az alábbi képlet alapján számítjuk ki. II-faktor egységek = _ (II-faktor-koncentráció%) x (térfogat ml-ben) HM) “ Egy II-faktor-egység ekvivalens azzal a II-faktor-aktivitással, amely 1 ml friss citrát-plazmában jelen van. B) A VH-faktor meghatározása: a) Reagensek: Vll-faktor hiányplazma: Egy súlyos VH-faktor-hiányban szenvedő (1%-nál kisebb VH-faktor-koncentrációjú) beteg citrát-plazmáját mélyhűtött állapotban tároljuk vagy 1 súly%/tf. HEPES hozzáadása után üofilizáljuk (pH-érték: 7,0). Citrátos konyhasó-oldat (hígítószerként a mintákhoz): 0,7% trinátrium-citrát. 2H20, 0,7% nátrium-klorid. 4„Thromborel” (kalciumtartalmú humán tromboplasztin), a Behringwerke AG (Marburg-Lahn) gyártmánya. b) Vizsgálati módszer: A hiányplazmát és a minta-hígításokat jégfürdőben tároljuk. A „Thromborel” készítményt a vizsgálat folyamán 37 C° hőmérsékleten tartjuk. A reagenseket a következőképpen pipettázzuk kémcsövecskékbe: 0,05 ml Vll-faktor hiányplazma 0,05 ml minta (hígítási sorozat a vizsgálandó mintából illetőleg egy normális plazmából vagy standard plazma-készítményből) Az elegyet 37 C° hőmérsékleten 1 percig inkubáljuk, majd: 0,2 ml „Thromborel”. A „Thromborel” hozzáadásától a megalvadásig terjedő időt stopperórával mérjük. c) A Vll-faktor koncentrációjának meghatározása: A Vll-faktor koncentrációját ugyanúgy számítjuk ki, amint ezt fentebb a II-faktor esetében ismertettük. C) A IX-faktor meghatározása: a) Reagensek: IX- faktor hiányplazma: Egy súlyos B-hemofiliában (IX-faktor-tartalom 1% alatt) szenvedő beteg citrát-plazmáját mélyhűtött állapotban tároljuk. F oszfolipid-kaolin-szuszpenzió : A Hormon-Chemie müncheni cég által gyártott, „Tachostyptan” márkájú foszfolipid-koncentrátumot Owrens-pufferrel 1 : 200 arányban hígítjuk és 0,5% kaolint (0,5 g/ 100 ml) adunk hozzá. Az elegyet mélyhűtve tároljuk. Oxalátos marha-plazma, bárium-szulfáton adszorbeáltatva (hígítószerként a mintákhoz): 9 rész marhavért 1 rész 1,34%-os nátrium-oxalát-oldattal elegyítünk. Az így kapott plazmát 10% bárium-szulfáton adszorbeáltatjuk. Centrifugálás után a plazmát adagonként letöltjük és mélyhűtve tároljuk. m/20 kalcium-klorid-oldat. b) Vizsgálati módszer: A IX-faktor hiányplazma inkubálása foszfolipid-kaolinszuszpenzióval: a hiányplazma szükséges mennyiségét ugyanolyan térfogatú foszfolipid-kaolin-szuszpenzióval elegyítjük, 5 percig inkubáljuk 30 C° hőmérsékleten, majd 30 percig jégfürdőben tartjuk. A reagenseket, amelyeket a kalcium-klorid-oldat kivételével a vizsgálat folyamán jégfürdőben tartunk, az alábbi módon pipettázzuk kémcsövecskékbe: 0,2 ml inkubált hiányplazma-foszfolipid-kaolin szuszpenzió 0,1 ml minta (hígítási sorozat a vizsgálandó mintából illetőleg egy normális plazmából vagy standard plazmakészítményből) Az elegyet 37 C° hőmérsékleten 1 percig inkubáljuk, majd: 0,1 ml m/20 kalcium-klorid-oldat (a vizsgálat folyamán 37 C° hőmérsékleten tartandó). A kalcium-klorid-oldat hozzáadásától a megalvadásig terjedő időt stopperórával mérjük. c) A IX-faktor koncentrációjának kiszámítása: A IX-faktor koncentrációját ugyanúgy számítjuk ki, ahogyan ezt a II-faktor esetében fentebb megadtuk. D) X-faktor meghatározása: a) Reagensek: X- faktor hiányplazma: Egy súlyos X-faktor-hiányban (X-faktor 1% alatt) szenvedő betegtől vett citrát-plazmát mélyhűtve tárolunk, vagy 1% HEPES hozzáadása és a pH-érték 7,0-ra való beállítása után liofilizálunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 5C 55 60 65 4
