180816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadást elősegítő készítmény előállítására emberi vérplazmából
9 180816 10 Citrát-konyhasó-oldat (hígítószer a mintákhoz): 0,7% nátrium-klorid, 0,7% nátrium-citrát. 2H20. „Thromborel” (kalciumtartalmú humán tromboplasztin), a Behringwerke AG (Marburg-Lahn) gyártmánya. b) Vizsgálati módszer: A reagenseket, amelyeket a vizsgálat során a „thromborel” kivételével jégfürdőben tartunk, az alábbi módon pipettázzuk kémcsövecskékbe: 0,05 ml X-faktor hiányplazma 0,05 ml minta (hígítási sorozatok a vizsgálandó mintából illetőleg a normális plazmából vagy egy standard plazma-készítményből) Az elegyet 37 C° hőmérsékleten 1 percig inkubáljuk, majd: 0,2 ml „Thromborel” (a vizsgálat folyamán 37 C° hőmérsékleten tartandó). A „Thromborel” hozzáadásától a megalvadásig terjedő időt stopperórával mérjük. c) A X-faktor koncentrációjának kiszámítása: A X-faktor koncentrációját ugyanolyan módon számítjuk ki, ahogyan ezt fentebb a Il-faktor esetében ismertettük. 3. Trombin-próba a) Reagensek: 1%-os fibrinogén-oldat (emberi eredetű) Standardizált trombin (Topostasin, Roche, 3000 NIH-trombin-egység üvegcsénként) Citrát-konyhasó-oldat: 0,7% nátrium-klorid, 0,7% nátrium-citrát. 2H20. b) Vizsgálati módszer: A liofilizált mintát a megadott mennyiségű desztillált vízben oldjuk, majd 6 hígítást készítünk mértani sorozatban, citrát-konyhasó-oldat felhasználásával, továbbá 8 hígítást mértani sorozatban a standardizált trombinból; a hígítási sorozatokat 1 NIH-egység/ml koncentrációval kezdjük Vizsgálati eljárás: 0,2 ml 1%-os fibrinogén-oldat és 0,2 ml minta (FEIBA anyagot tartalmazó frakció- és trombin-hígítások, valamint tiszta citrát-konyhasó-oldat vakpróbaként) elegyét 37 C° hőmérsékleten inkubáljuk. A megalvadásig eltelő időt mérjük, a kémcsövecskéknek egyre nagyobbodó időközökben (10 perctől I óráig) történő megdöntése útján. Ez a folyamat legalább 6 óra hosszat tart. A kémcsövecskék utolsó megdöntése az éjjelen át való inkubálás után történik. A vakpróbának (hígítószer vizsgálandó minta nélkül) éjjelen át stabilnak kell mutatkoznia, alvadék képződése nélkül. c) A trombin-koncentráció kiszámítása: Kalibrációs görbét készítünk oly módon, hogy a standard trombin-készítmény mértani hígítási sorozatával kapott alvadási időket a megfelelő minta-koncentrációkkal (trombinegység/ml) vetjük össze kétszeres logaritmusos milliméterpapíron. A vizsgálandó minták hígítási sorozatának trombinkoncentrációit a kalibrálási görbe felhasználásával, a megfelelő hígítási faktorral való szorzás útján számítjuk ki. A kapott eredmények átlagértéke megfelel a vizsgálandó minta trombin-aktivitásának, trombin-egység/ml-ben kifejezve. Ha az így kapott értéket az oldat-térfogattal (ml) szorozzuk, úgy megkapjuk az üvegcsénként jelenlevő összes trombin mennyiségét egységben. 4. Az amidolitikus aktivitás meghatározása a) Reagensek: Kromogén szubsztrátumok: S—2160: N-benzoil-L-fenilalanil-L-valil-L-arginin-p-nitroanilid-hidroklorid (rövidítve: Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid. HC1) 0,5 mg/ml H2O = 0,73 m mólos S—2222: N-benzoil-L-izoleucil-L-glutamil-L-glicil-L-arginil-p-nitroanilid-hidroklorid (rövidítve: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid. HC1) 1,4mg/ml H20= 1,91 m mólos S—2251 : D-valil-L-leucil-L-lizil-p-nitroanilid-dihidroklorid (rövidítve: D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid. 2HCI) 1,65 mg/ml H20 = 2,99 m mólos Puffer: 6,06 g „Tris” - trisz(hidroxi-metil)-amino-metán = 0,05 mólos 0,6 g nátrium-klorid = 0,18 mólos 1 liter desztillált vízben oldjuk, majd az oldat pH-értékét tömény sósavval 7,4-re állítjuk be. h) Vizsgálati eljárás: 1,0 ml puffer 0,1 ml vizsgálandó minta (FEIBA anyagtartalmú készítmény) 0,2 ml szubsztrátum (S—2160, S—2222 illetőleg S—2251). Ezt az elegyet egy 37 C° hőmérsékletre beállítható küvetába (rétegvastagság: 1 cm) töltjük és fotométerrel, 405 nmrél mérjük 1 perces időközökben az optikai sűrűség növekedését. e) Értékelés: Mindenkor legalább 5 mérés átlaga alapján számítjuk ki az optikai sűrűség percenkénti megnövekedésének az átlagértékét és ezt 1000-rel szorozzuk; ezt az értéket AOD.IO3/ perc értéknek nevezzük; ez az érték a vizsgált minta amidolitikus aktivitásának (enzim-aktivitásának) a mindenkor felhasznált szubsztrátumra vonatkoztatott jellemzésére szolgál. Ha a fenti módon meghatározott AOD. 103/perc értéket a vizsgált minta FEIBA-egységekben kifejezett aktivitásával (az alkalmazott minta 0,1 ml mennyiségére vonatkoztatva) illetőleg a II-, VII-, IX- és X-faktor-egységekben (0,1 ml mennyiségre vonatkoztatva) osztjuk, akkor megkapjuk az adott esetben alkalmazott vizsgálati mintára, az adott vizsgálati körülmények között jellemző „specifikus amidolitikus aktivitás”-értéket, vagyis az 1 FEIBA-egységre illetőleg 1II-, VII-, IX- ill. X-faktor-egységre vonatkoztatott AOD.IO3/ perc értéket. A fenti 1. és 2. példában leírt módon előállított készítmények a fent ismertetett módon lefolytatott vizsgálatok során az alábbi táblázatban megadott tulajdonságokat mutatták. A táblázatban a zárójelbe tett értékek a FEIBA-egységekhez viszonyított arányt mutatják az egyes faktor-egységek esetében. Az amidolitikus aktivitásnál zárójelben megadott számértékek a „specifikus amidolitikus aktivitás” értéket, vagyis a mindenkori AOD.103/perc értéket adják meg, a leírt vizsgálati rendszerbe bevitt 1 FEIBA-egységre vonatkoztatva. Táblázat 1. Példa 2. Példa Az oldat térfogata 20 ml 20 ml FEIBA-egység palackonként 470 280 II-faktor-egység palackonként 610 (1,30) 240 (0,86) VII-faktor-egység palackonként 520 (1,11) 260 (0,93) IX-faktor-egység palackonként 700 (1,49) 300 (1,07) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
