180816. lajstromszámú szabadalom • Eljárás véralvadást elősegítő készítmény előállítására emberi vérplazmából
5 180816 6 kély amidolitikus aktivitást tapasztalunk. Másrészről ha valamely trombint és/vagy Xa-faktort tartalmazó készítményt vizsgálnánk, amelyet a találmány szerint előállított készítménnyel azonos nagyságú FEIB-aktivitásra állítottunk be, akkor nagyfokú amidolitikus aktivitást tapasztalnánk. A találmány szerinti eljárással előállított készítmény további jellemző tulajdonsága, hogy csak igen csekély trombin-aktivitást mutat vagy egyáltalán nem rendelkezik ilyen aktivitással. A találmány szerinti eljárással előállított készítmény esetében a trombin-aktivitásnak a FEIB-aktivitáshoz való viszonya nem nagyobb, mint 0,02, mimellett itt a trombin-aktivitást NIH (US National Institute of Health) egységekben, a FEIB-aktivitást pedig FEIBA-egységekben fejezzük ki. A tatálmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait és a találmány szerinti eljárással előállítható készítmény tulajdonságait az alábbi példák és vizsgálati eredmények szemléltetik. 1. példa Frissen fagyasztott vérplazmát 0 C° és - 4 C° közötti hőmérsékleten felengedni hagyunk és az így kapott Kryo-precipitatumot centrifugálással eltávolítjuk. A szupematáns folyadék pH-értékét 0,5 n sósavval 7,0-ra állítjuk be, 1 liter folyadékra 5 g kaolint adunk hozzá és + 4 C° hőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük. Ezután a kaolint centrifugálással eltávolítjuk. A képződött FEIBA-hatóanyagot — a protrombin-komplex faktoraival együtt — dietilaminoetilcsoportokat tartalmazó Sephadex gyantán adszorbeáljuk. Erre a célra 1 liter szupernatáns folyadékhoz 0,5 g DEAESephadex A—50 gyantát adunk és +4 C° hőmérsékleten 1/2 óra hosszat keverjük. Az ioncserélőt ezután elkülönítjük; a szupernatáns plazma gamma-globulin és albumin kinyerésére használható fel. A DEAE-Sephadex gyantát trinátriumcitrátot és nátrium-kloridot tartalmazó oldattal kétszer mossuk, miközben a pH-értéket 7,5-ön tartjuk. Eluálás céljából a DEAE-Sephadex gyantát 3% nátriumkloridot és 0,1% trinátrium-citrát-dihidrátot tartalmazó oldattal (az eredeti plazma-térfogat 2%-a) 20 percig keverjük, majd az eluátumot szűréssel elkülönítjük. Az így kapott eluátumot egy 0,05% trinátrium-citrát-dihidrátot és 0,1% nátrium-kloridot tartalmazó oldattal szemben, 7,0 pH-értéken, + 4 C° hőmérsékleten éjjelen át dializáljuk, majd megfagyasztjuk és egy első liofilizálási folyamatnak vetjük alá. Az így kapott nyers termékben meghatározzuk a FEIB-aktivitást, valamint a jelenlevő protrombin-komplex-faktorok aktivitását is. A gyógyászati célra alkalmazható FEIB-aktivitású készítmény előállítása céljából oly anyagból indulunk ki, amelyben a II-VII-IX-X-faktor egységeknek a FEIBA-egységekhez viszonyított aránya 0,5 és 2 között van; ez a viszony a megfelelő nyers termékek különböző előállítási adagjainak összekeverése útján állítható be. Az így kiindulási anyagként alkalmazott nyers terméket pirogénmentes desztillált vízben oldjuk, olyan koncentrációban, hogy az oldat FEIB-aktivitása 10—50 egység/ml legyen (adott esetben például 25 FEIBA-egység/ml). Az izotóniás oldat előállításához szükséges sók hozzáadása és a pH-értéknek 7,0 és 7,5 közöttire történő beállítása után az oldatot membrán-szűrőn keresztül derítjük, majd végül egy 0,2 gm nyílású membránszűrőn keresztül sterilre szűrjük. Az így kapott oldatot steril körülmények között, 20ml-es adagokban edényekbe töltjük, mélyhűtéssel fagyasztjuk és liofilizáljuk. 2. példa Kiindulási anyagként ismét frissen fagyasztott vérplazmát illetőleg az ebből az 1. példában leírt módon kapott szupernatánst alkalmazzuk. Ennek natív állapotban 7,8 a pH-értéke; a pH-érték további beállítása nélkül 1 liter szupernatánsra számítva 10 g „Celit 512” adszorbenst adunk hozzá és + 4C° hőmérsékleten 3 óra hosszat keverjük. Az adszorbenst centrifugálással elkülönítjük, majd a kapott szupematánst, amely a keletkezett FEIBA-anyagot tartalmazza, az !. példában leírt módon dolgozzuk fel. A fenti példákban leírt módon előállított készítményeket azután a szokásos biztonsági vizsgálatok [sterilitás, ártalmatlanság, pirogén-mentesség, HBs-antigén-mentesség mellett hatásosságra, (FEIBA-aktivitásra), protrombin-komplex-faktor-tartalomra, trombin-tartalomra, valamint amidolitikus aktivitásra (a fentebb említett S—2160, S—2222 és S—2251 szubsztrátumokkal)] vizsgáljuk. Az egyes vizsgálatokat az alább leírt módon folytattuk le: 1. Hatásossági próba (a FEIBA-egységek meghatározása) a) Reagensek: Vili-faktor inhibitor-plazma: Egy A-hemofíliában szenvedő, Vili-faktorral szembeni inhibitorral rendelkező beteg citrát-plazmáját (inhibitortiter: legalább 10 egység/ml) liofilizáljuk. A vizsgálat folyamán az inhibitor-plazmát jégfürdőben tartjuk. Foszfoiipid-kaolin-szuszpenzió: A Hormon-Chemie müncheni cég által gyártott, „Tachostyptan” márkájú foszfolipid-koncentrátumot Owrens-pufferrel 1 : 200 arányban hígítjuk és 0,5% kaolint (0,5 g/ 100 ml) adunk hozzá. Az elegyet mélyhűtve tároljuk. A vizsgálat folyamán ezt a reagenst szobahőmérsékleten tartjuk. Citrát-konyhasó-oldat a minták hígítására: 0,7% nátrium-klorid, 0,7% nátrium-citrát. 2H20. m/20 kalcium-klorid-oldat: A vizsgálat folyamán 37 C° hőmérsékleten tartjuk. b) Vizsgálati módszer: A vizsgálandó FEIBA-anyagot tartalmazó frakcióból származó mintát és egy meghatározott egységszám/ml FEIBA-anyag tartalmú standard-készítményt a megadott mennyiségben desztillált vízben oldunk, majd citrát-konyhasó-oldat felhasználásával 6 hígítást készítünk mértani sorozatban, amelyet 5 FEIBA egység/ml koncentrációval kezdünk el. Ezeket a hígításokat a vizsgálat folyamán jégfürdőben tartjuk. A reagenseket az alábbi módon pipettázzuk kémcsövecskékbe: 0,05 ml Vili-faktor inhibitor-plazma 0,05 ml minta (a vizsgálandó minták és a standard-készítmény hígításai, valamint egy tiszta citrát-konyhasóoldat vakpróbaként) 0,05 ml foszfoiipid-kaolin-szuszpenzió az elegyeket 37 C° hőmérsékleten 6 percig inkubáljuk, majd: 0,5 ml m/20 kalcium-klorid-oldat. Stopperórával mérjük a kalcium-klorid-oldat hozzáadásától az alvadék-képződésig eltelő időt (az alvadék-képződést a kémcsövecske megdöntése vagy egy automatikus koagulometer alkalmazása útján állapítjuk meg). c) A FEIBA-egységek kiszámítása mintánként: Kalibrációs görbét készítünk oly módon, hogy a FEIBA anyag tartalmú standard-készítmény hígításainak másodpercekben mért megalvadási idejét a megfelelő (FEIBA- egység/ml egységekben mért) koncentrációkkal állítjuk szembe kettős logaritmikus milliméterpapíron. A vizsgálandó minták hígításainak FEIB-aktivitását a kalibrációs görbe alapján, a megfelelő hígítási faktorral való szorzás után 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
