180787. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztein-tartalmú peptidek előállítására
3 180787 4 mentes peptidet szerves oldószerekben — például dietil-éterben, diizopropil-éterben vagy etil-acetátban leválasztjuk. Ezt a feldolgozási módot előnyösen akkor alkalmazzuk, ha a kapott peptid nehezen oldódik vízben. Ha esetleg a pepiidben savval könnyen lehasítható egyéb védőcsoportok - például 3,5-dimetoxi-, -dimetil-benziloxi-karbonil- (bdz)-, terc-butoxi-karbonil- (Boc)-csoport vagy terc-butil-észter- és terc-butil-éter-csoport — is voltak, úgy ezek a találmány szerinti eljárás során ugyancsak lehasadnak. A védőcsoport minőségétől függ a reakcióidő. A terc-butil-típusú védőcsoportok teljes lehasításához 50%-os trifluor-ecetsav-etil-merkaptán-oldatban mintegy 4 óra szükséges. Hosszabb, több nem-védett merkaptocsoportot tartalmazó peptidek esetében előnyösen megismételjük a hasítást. A triíluor-ecetsav-etil-merkaptános tritil-hasítás melléktermékeként S-tritil-merkapto-etán képződik, amely a feldolgozás során a szerves fázisba kerül. A találmány szerinti eljárást igen előnyösen alkalmazhatjuk magasabb molekulasülyú peptideknél, melyeknél — oldhatósági okokból és oxidációs érzékenység miatt — a jódos hasítás már nem vezet célhoz. Peptidek, amelyek metanolban vagy vizes ecetsavban már alig oldódnak, igen könnyen feloldódnak a találmány szerinti trifluor-ecetsav-merkaptán elegyekben. így például mintegy 70%-os kitermeléssel előállítottunk egy szintetikusan felépített, védett humán-inzulin-A-láncot úgy, hogy kétszeri trifluor-ecetsav-etil-merkaptános kezeléssel eltávolítottuk a négy S-tritilcsoportot és a hét terc-butil-védőcsoportot. A szabad, redukált inzulin-A-láncot — jellemzés céljából — tetraszulfonáttá alakítottuk. Olyan termék keletkezett, amely mind a savas elektroforézis, mind a vékonyrétegkromatográfia szempontjából azonosnak bizonyult a természetes humán-inzulin-A-lánccal. A fentiek szerint előállított cisztein-tartalmú peptideket közvetlenül felhasználhatjuk gyógyászati célokra, mint például a Szomatosztatint a pankreatitis kezelésére, vagy közbenső vegyületekként a nagyobb molekulasúlyú, gyógyászati szempontból hasznos peptidek előállításához. A példákban a bárium-szulfátra lecsapott palládiumot 200—500 ml reakcióelegyre számítva 1 kávéskanálnyi mennyiségben alkalmazzuk. 1. példa aj H-Cys-Asn-OH-triliuor-acetát ax) 25 ml etil-merkaptán és 25 ml trifluor-ecetsav elegyéhez keverés közben 5,34 g (10 millimól) H-Cys(Trt)-Asn-CBu'-t [Helv. Chim. Acta, 54. 398 61 971] adunk. A reakcióelegyet 4 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd beleöntjük 250 ml vízbe. Éterrel háromszor extraháljuk, a fázisokat elválasztjuk és a vizes fázist liofilizáljuk. Kitermelés: 3,271 g (89%). [«]” = + 3,0° (c= 1, metanolban). Elem-analízis a C7H13N3O4S ■ CF3COOH H20 összegképlet alapján (molekulasúly: 367,3): számított: C = 29,40%; H = 4,39%; N = 11,44%; S = 8,73%; H20 24,9%, talált: C = 30,5 %; H = 4,0 %; N = 11,2 %; S = 8,9 %; H20=4,6%. a2) 7,5 ml etil-merkaptán és 7,5 ml trifluor-ecetsav elegyéhez keverés közben 1,6 g (3 millimól) H-Cys(Trt)-Asn-OBu-t adunk. A reakcióelegyet 4 órán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd beleöntjük 50 ml diizopropil-éterbe. A csapadékot leszívatjuk és diizopropil-éterrel mossuk, majd szárítjuk. Kitermelés: lg (91%) • [a]n = +3,6° (c=l, vízben). A kapott anyag vékonyrélegkromatográfiai szempontból azonos az a,) példában kapott vegyülettel. a3) Az a2) példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy diízopropil-éter helyett dietil-étert alkalmazunk. Kitermelés: 0,95 g (86%). [<x]d= +3° (c=l, vízben). A kapott anyag vékonyrétegkromatográfiai szempontból azonos az aj) példában kapott vegyülettel. a+) 3,7 ml merkapto-ecetsav és 3,7 ml trifluor-ecetsav elegyéhez keverés közben 533,7 mg (1 millimól) H-Cys(Trt)-Asn-OBu'-t adunk. A reakcióelegyet 4 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd beleöntjük 50 ml dietil-éterbe. A csapadékot leszívatjuk és dietil-éterrel mossuk. Kitermelés: 210 mg (57%). [a]í)2 = 2,9° (c= 1, vízben). b) (H-Cys-Asn-OH)2 (H-Cys-Asn-OH jódos oxidációjával) 2,6 g (7 millimól) H-Cys-Asn-OH.CF3COOH.H20-t feloldunk 25 ml 40%-os ecetsavban, majd jód 0,1 n ecetsavas oldatával titráljuk. 67,8 ml jód-oldat fogy (megfelel 97%nak). A reakcióelegyet ezután töményítjük, a maradékot feloldjuk vízben és a vizes oldatot éterrel kirázzuk. A vizes fázist liofilizáljuk. Kitermelés: 2,42 g (97,6%). Elem-analízis a C7H12N304S • 0.8 HJ ■ H20 összegképlet alapján (molekulasúly: 354,6): számított: C = 23.71%; H = 4,20%; N= 11,85%; S=9,04%; J = 28,63%; talált: C = 24,1 %; H = 4,l %; N=10,5 %; S = 8,6 %; J = 28,4%. A fentiekben kapott termék 500 mg-ját kevés vízben oldjuk és 25 x 1,5 cm-es (acetát-alakú) Amberlit IR 45 oszlopon kromatografáljuk. Az eluátumot liofilizáljuk. Kitermelés: 260,04 mg (67%; az oxidálatlan termékre vonatkoztatva). T [cJq = —62,1° (c = 1, vízben). Elem-analízis a C7H12N304S • 0,25 CH3COOH ■ H20 öszszegképlet alapján (molekulasúly: 268,3): számított: C = 33,57%; H = 6,01%; N= 15,66%; ecetsav = 5,59%; H20 = 6,l%, talált: C = 34,5 %; H= 5,7 %; N = 16,0 %; ecetsav=5,7 %; H20 = 6,9%. 2. példa a) H- Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH-trifluor-acetát 639,8 mg (0,5 millimól) H-Leu-Glu(OBu')-Asn-Tyr(Bu')-Cys(Trt)-Asn-OBu'. CH3COOH-t feloldunk 2,5 ml etil-merkaptán és 2,5 ml trifluor-ecetsav elegyében. A reakcióelegyet 4 órán keresztül szobahőmérsékleten keverjük, majd 50 ml vízbe öntjük. A vizes fázist éterrel háromszor extraháljuk, azután liofilizáljuk. Kitermelés: 331,5 mg (73%). [«];?= - 30,4° (c = 1, vízben). Elem-analízis a C31H4öN8Oi2S • CH3COOH ■ 2H20 öszszegképlet alapján (molekulasúly: 904,9): számított: C = 43,80%; H = 5,45%; N= 12,38%; S = 3,54%; talált: C = 44,4 %; H = 5,6 %; N = 12,3 %; S = 3,8 %. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
