180783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozinÓ1(inex lent) és/Asn2(index fölt)/-analógjai előállítására
9 180783 10 kémhatásának biztosítására a rendszerhez időről időre kis mennyiségű Et3N-t adunk. A képződött oldhatatlan melléktermékeket kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. Az olajos maradékot vizes kezeléssel megszilárdítjuk. A kapott nyers terméket kloroformban felvesszük, a kloroformos oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd betöményítjük. A kivált kis mennyiségű szilárd anyagot (amely szennyezésként jelentős mennyiségű diciklohexil-karbamidot tartalmaz) kiszűrjük, és a szűrletet petroléterrel kezeljük. Kristályos termék formájában 8,0 g (51,4%) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 102—105 C°, [«]“= 12,5° (c=l, DMF). c) 4,74 g (20 mmól) H-Glu(OBzl)-OH-t dörzsmoisárban eldörzsölünk, majd dimetilformamidos közegben, keverés közben 0,7 g (20 mmól) Boc-Glu(OBzl)-OSu-val és 3,6 ml NMM-el kezeljük. A képződött oldatot sziruppá bepároljuk, és a maradékot vízzel kezeljük. A kapott olajos csapadékot etilacetátban felvesszük, az oldatot egymás után 5%-os vizes ecetsav-oldattal és vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd szárazra pároljuk. A maradékként kapott 14,03 g átlátszó olajat petroléterrel fedjük, és a rendszert állni hagyjuk. Olajos termékként 10,2 g (90,0%) Boc-Glu(Obzl)-Glu(OBzl)-OH-t kapunk, amely vékonyrétegkromatográfiás vizsgálat szerint egységes. [a]”= — 7,59° (c= 1, DMF). d) 28,2 g (46 mmól) Boc-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 1 órán át 1,1 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a kapott olajos maradékról két ízben friss tetrahidrofuránt párolunk le. Az olajos maradékot nagy mennyiségű éterrel kezelve megszilárdítjuk. Az így kapott szilárd HC1 • H-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, 25,6 g (46 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-OH, 10,6 g (92 mmól) HOSu, 10,9 g (53 mmól) DCC és 540 ml dimetilformamid elegyét 1 órán át 0 C°-on, majd 48 órán át 25 C’-on keverjük. Az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez időről időre Et3N-t adunk (összesen körülbelül 16 ml Et ,N-t adagolunk be). A kivált oldhatatlan melléktermékeket leszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott nyers terméket kloroformban oldjuk, az oldatot vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, végül szárazra pároljuk. A maradékot petroléteres kezeléssel megszilárdítjuk, majd izopropanolból átkristályosítjuk. 28,9 g (59,8%) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 169— 175 C\ [a]2J= - 11,78° (c= 1, DMF). 3,9 g (3,48 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 30 percig 15 ml 4n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk; ezalatt az elegyből kevés kristályos termék válik ki. Az elegyhez 210 ml étert adunk, a kivált szilárd anyagot elkülönítjük, éterrel mossuk, majd metanol és éter elegyéből kristályosítjuk. 2,58 g (75,1%) HCl • H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 148—151 C°, [a]“= -3,65° (c= 1, DMF). e) 12,6 g (40 mmól) Boc-Val-OSu-t 250 ml dimetilformamidban, 2 ml Et3N jelenlétében 4,68 g (40 mmól) H-Val-OH-val kondenzálunk. A reakciót 96 órán át végezzük; ezalatt az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez szükség szerint további mennyiségű F.t,N-t adunk. A kivált oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűdetet 45 C°-on szárazra pároljuk. A maradékot éter és híg (körülbelül 1%-os) vizes kénsavoldat között megoszlatjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A habszerű üveg formájában kapott maradékot éter és petroléter elegyéből kristályosítjuk. 12,2 g (96,4%) Boc-Val-Val-OH-t kapunk; op.: 155-158 C°, [a]^s= + 1,10° (c= 1, DMF). 40,5 g (128 mmól) Boc-Val-Val-OH-t 60 percig 1,8 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a maradékot éterrel kezeljük. Fehér, amorf porként 34,5 g HCl • H-Val-Val-OH-t kapunk. Ezt a vegyületet 1 liter dimetilformamidban, 54 ml Et3N jelenlétében 24 órán át 55,6 g (128 mmól) Boc-Glu(OBzl)-OSu-val reagáltatjuk. A kivált kevés oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot 1,5 liter etilacetátban felvesszük, és az oldatot 5%-os vizes ecetsav-oldattal kétszer, majd vízzel háromszor mossuk. A szerves fázist nátriumszulfát fölött szárítjuk, majd szárazra pároljuk. Átlátszó, színtelen, nem kristályosodó olajat kapunk. Ezt az anyagot 3,2 liter éterben oldjuk, és az oldathoz 7,5-es pH-érték eléréséig CHA-t (17 ml) adunk. A kivált szilárd sót leszűrjük és metanol és éter elegyéből átkristályosítjuk. 58,9 g (72,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH • CHA-t kapunk; op.: 158— 160 C°, [a]" = 33,41° (c= 1, metanol). 1,69 g (2,66 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH ■ CHA-t választótölcsérben 40 ml víz és 40 ml etilacetát keverékében szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 4 ml 1 mólos vizes kénsavoldatot adunk, és alaposan összerázzuk. A szilárd anyag feloldódik. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel többször mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és bepároljuk. A kapott 1,45 g olajos maradékot, azaz a szabad tripeptidet 15 ml dimetilformamidban, 0,612 g (5,32 mmól) HOSu, 0,3 ml (2,66 mmól) NMM és 0,63 g (3,06 mmól) DCC jelenlétében 2,58 g (2,61 mmól) HC1 • H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-el kondenzáljuk. A reakciót 1 órán át 0 C°-on, majd 60 órán át 25 C°-on végezzük; az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez szükség esetén további mennyiségű NMM-t adunk. A kivált oldhatatlan mellékterméket kiszűrjük, és a szűrletet 45 C°-on szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot vizes kezeléssel megszilárdítjuk. A nyers, szilárd terméket 50 ml dimetilformamidban oldjuk, és 300 ml metanollal kicsapjuk. 2,25 g (58,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 277 280 C°, [a]”=- 12,43° (c=l, DMF). 0,72 g (0,49 mmól), a fentiek szerint kapott terméket 40 ml dimetilformamid, 30 ml metanol és 2 ml víz Hegyében, 0,5 g 5%-os palládium/báriumszulfát katalizátor jelenlétében, 3,4 atmoszféra nyomáson 3 órán át hidrogénezünk. Az elegyet szűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot 30 percig 5 ml TFA-val kezeljük, az elegyet bepároljuk, és az így kapott maradékot éterrel többször eldörzsöijük. A képződött fehér, szilárd anyagot 20 ml vízben felveszszük, és az elegyet fagyasztva szárítjuk. A kapott 0-,47 g súlyú nyers terméket Bio-Rad AG1-X 2 gyantával (erősen bázikus polisztirol-gyanta) töltött és ammóniumacetátpufferoldattal (ammóniával pH = 8,1 -re lúgosított 2%-os vizes ecetsav-oldat) egyensúlyba hozott, 3 x 32 cm méretű gyantaoszlopra visszük fel. Az oszlopot rendre 200—200 ml 0,025 mólos ammóniumacetát-oldattal (pH = 5,5), 0,025 mólos ecetsav-oldattal, 0,05 mólos ecetsav-oldattal, 0,1 mólos ecetsav-oldattal, 0,25 mólos ecetsav-oldattal, 0,5 mólos ecetsav-oldattal, 0,75 mólos ecetsav-oldattal, végül 1 mólos ecetsav-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 12ml-es frakciókba 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
