180783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozinÓ1(inex lent) és/Asn2(index fölt)/-analógjai előállítására
7 180783 ven lehasítjuk. A kapott, HC1 ■ H-Ala-Ala-OBzl képletű dipeptidészter-sót König és Geiger módszerével [Chem. Bér. 103, 788 (1970)] Boc-Asn-OH-val kapcsoljuk, majd a képződött, Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl képletű védett tripeptid-észter Boc-csoportját tetrahidrofurános közegben végzett sósavas kezeléssel lehasítjuk. Az így kapott HC1 • H-Asn-Ala-Ala-OBzl képletű sót a DCC/HOBT módszer szerint ll3C-CO-Ser(Bzl)-OH • DCHA-val kondenzáljuk, végül a képződött H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl képletű védett tetrapeptidet hidrazinolízisnek vetjük alá. A kívánt H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-HNNH2 képletű hidrazidot jó hozammal kapjuk. A fenti hidrazid és a TFA • H-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-GIu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett dekapeptid fragmenskondenzációjával a H3C-ÇO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-IIe-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett tetradekapeptidet állítjuk elő. Ezt a vegyületet ezután a fent ismertetett, védőcsoportmentes C-terminális aminosavrészt tartalmazó tetradekapeptid trifluorecetsavas sójával kapcsoljuk, és így védett [Asn2]-timozin-Oj-et állítunk elő. A kapott vegyület összes védőcsoportját vízmentes hidrogénfluoriddal végzett kezeléssel lehasítjuk, majd a vegyületet ioncserés oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Végtermékként [Asn2]-timozin-a1-et kapunk. A H3C-CO-Ser(Bzl)-Asn-AIa-Ala-Val-Asp(OBzl)-Thr(BzI)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH képletű védett tetradekapeptid védőcsoportjait ugyanezzel a módszerrel távolíthatjuk el; ekkor a H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH képletű acetilezett tetradekapeptidhez jutunk. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a fenti szintézisben közbenső termékként képződött peptidek számos képviselője a T-sejtek szabályozását, differenciálódását és funkcióját befolyásoló aktivitással rendelkezik. Ezek a peptidek a következők: Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, H3C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys és H3C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile--Thr-Thr-Lys. A timozin-a,-et, [Asn2]-timozin-aret, illetve az előzőekben felsorolt új okta-, undeka- és tetradekapeptideket, valamint e vegyületek gyógyászatilag alkalmazható sóit parenterális úton (így intravénás, szubkután vagy intramuszkuláris adagolással) juttathatjuk be a kezelendő melegvérű emlősök szervezetébe. Ezek a vegyületek körülbelül 1—100 mg/testsúly kg-os napi intravénás dózisban adagolva erős immúnfokozó aktivitással rendelkeznek. A szükséges napi dózis nyilvánvalóan a kezelendő rendellenességtől, a rendellenesség súlyosságától és a kezelés időtartamától függően változik. Gyógyászati felhasználás szempontjából alkalmas dózisegységeknek bizonyultak az 1 mg liofilizált timozin-c^-et, [Asn2]-timozin-aret, illetve a fent felsorolt peptid-fragmenseket tartalmazó készítmények, amelyekhez felhasználás előtt steril vizet vagy fiziológiás sóoldatot kevprnek. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. A leírásban és az igénypontokban alkalmazott rövidítések jelentése a következő: Boc = terc-butoxikarbonil-csoport, Bzl = benzil-csoport, DCC = diciklohexil-karbodiimid, DMF=dimetilformamid, THF=tetrahidrofurán, HOSu= N-hidroxi-szukcinimid, Triton B = trimetil-benzil-ammóniumhidroxid 40%-os metanolos oldata, NMM — N-metil-morfolin, CHA = ciklohexilamin, DCHA = diciklohexilamin, Z = benziloxikarbonil-csoport, DMSO = dimetilszulfoxid, TFA = trifluorecetsav, Et3N = trietilamin, HOBT = 1-hidroxi-benzotriazol. Megjegyezzük, hogy a timozin-oi] és [Asn2]-timozin-a, szintézisét speciális védőcsoportok alkalmazása kapcsán ismertetjük; szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a konkrétan megnevezett védőcsoportok helyett egyéb, azokkal egyenértékű védőcsoportok is felhasználhatók. 1. példa A) műveletsor: a) 11,0 g (47,5 mmól) Boc-Asn-OH 200 ml metanollal készített oldatához 20 ml vizet adunk. Az oldat pH-ját 20%-os vizes Cs2C03-oldattal 7,0-ra állítjuk (ehhez körülbelül 55 ml oldatra van szükség). Az elegyet szárazra pároljuk, és a maradékról 45 C°-on 2 x 120 ml dimeíilformamidot párolunk le. A kapott fehér, szilárd anyaghoz 8,9 g (52 mmól) benzilbromidot és 120 ml dimetilformamidot adunk, és az elegyet 6 órán át keverjük. A reakcióelegyet szárazra pároljuk, és a maradékot nagymennyiségű vízzel kezeljük. A termék azonnal megszilárdul. A terméket leszűrjük, etilacetátban oldjuk, az oldatot vízzel mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, végül bepároljuk, és a kapott szilárd anyagot etilacetát és petroléter elegyéből kristályosítjuk. 13,8 g (90,3%) Boc-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 120-122 C°,[ag= ~ 17,29° (c= 1, DMF). 13,7 g (42,4 mmól) Boc-Asn-OBzl-t 80 ml tetrahidrofuránban oldunk, és az oldathoz 500 ml 4 n tetrahidrofurános sósavoldatot adunk. Az elegyet 45 percig állni hagyjuk; ezalatt az elegyből a termék egy része kiválik. Az elegyhez 1000 ml étert adunk. Az éter hatására azonnal kivált fehér, szilárd anyagot leszűrjük, éterrel mossuk, és vákuumban, szemcsés nátriumhidroxid fölött szárítjuk. 10,3 g (94%) HCI ■ H-Asn-OBzI-t kapunk; op.: 122—126 C, [ag= +6,82°. b) 7,0 g (29,5 mmól) H-Glu(OBzl)-OH-t dörzsmozsárban finomra aprítunk, majd az őrölt anyaghoz 8,88 g (32,3 mmól) Boc-Ala-OSu-t, 250 ml dimetilformamidot és 6 ml NMM-t adunk, és az elegyet 48 órán át keverjük. A reakcióelegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a reakció során az elegyhez további kis mennyiségű NMM-t is adunk. Az oldószert lepároljuk, és a maradékot 300 ml etilacetát és 500 ml víz és 2 ml 10%-os vizes sósavoldat elegye között megoszlatjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel háromszor mossuk, nátriumszulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. A maradékot kevés éterben felvesszük, és az elegyhez nagy térfogatú petrolétert adunk. Fehér, amorf, vékonyrétegkromatográfiásan egységes szilárd anyagot kapunk. Az így kapott 11,0 g (91,5%) Boc-Ala- Glu(OBzl)-OH 84—88 C°-on olvad; [a]“=8,08° (c = 1, DMF). 10,4 g (25,4 mmól) Boc-AIa-Glu(OBzl)-OH-t, 6,56 g (24,5 mmól) HC1 • H-Asn-OBzl-t és 5,9 g (50,8 mmól) HOSu-t 250 ml 0 C°-os dimetilformamidban oldunk, és az oldathoz 5,7 g (27,6 mmól) DCC-t, majd közvetlenül ezután 3,5 ml Et3N-t adunk. Az elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd 40 órán át 25 C°-on keverjük; ezalatt az elegy enyhén lúgos 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
