180566. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-tronin előállítására mikrobiológiai úton
3 "Í80 566 4 pimelinsavra, metioninre, izoleucinre van Szüksége, E. coli ATCC 21148 csak diamino-pimelinsav és metionin jelenlétében növekszik, az E. coli ATCC törzs növekedési adaléka a diaminopimelinsav. Ezen túlmenően az tenyészléhez lizint is kell adni. A fermentálást 20—40 °C-on végzik. 7,5%" fruktózt tartalmazó közegben a nevezett törzsek Ugyan L-tréonint termelnek, de az L-treonin koncentrációja a fermentáció során először növekszik, később azonban a degradáció kövétkeztében csökken. A tenyészléhez antibiotikumokat adnak, hogy az L-treonin feldúsulásának időszakát meghosszabbítsák, koncentrációjának csökkenését megakadályozzák. Antibiotikumként streptomicint, tetraciklint, kanamicint, polimyxint vagy azok keverékeit alkalmazzák. Ha a fermentáció 'megindítása után 40 órával streptomicint adnak a tenyészléhez, a fermentáció időtartamát 120 órára lehet nyújtani, és az L-tréonin szintje eléri a 13,2 g/1 értéket (ez a 7,5% fruktózt tartalmazó közegben tenyésztett Ë. coli ATCÇ 21148 törzsre* vonatkozik). Az antibiotikum koncentrációja a tápközegben 10—1000 mg/1 (1 579 835. sz." francia szabadalmi leírás.). Az említett eljárás fő hátránya, hogy a fermentáció során a termék íeldúsulásának átlagsebessége alacsony : 0,15—0,20 g/1 óra, ami alacsony feldúsulási szintet vagy hosszú fermentációt eredményez. Az eljárás további hátránya, hogy járulékos komponensek, így diamino-pimelinsav, metionin, izoleucin adagolása szükséges. A termelő törzs ezeket a komponenseket elfogyasztja. Találmányunk célkitűzése, hogy új termelő törzs alkalmazása és a tenyésztési körülmények módosítása révén az L-treonin íeldúsulásának .sebességét növeljük és a fermentáció időtartamát csökkentsük. A ‘fenti feladatot olyan éíjarással oldjuk meg, '”!'àméïÿnek során' egy Mschérichiá1 coli termelő törzset nitrogén- és1 SZénforrást, valamint' ásványi sókat tartalmazó tápközegben antibiotikumok jelenlétében süllyesztett kultúrában te- '‘"hyésztünk. A találmány szëtinti eljárásra jellemző, hogy termelő törzsként az Escherichia " "coli-nak á Szövetségi Genetikái Kutató Intézet ‘ Mikrobiológiai Letétbéhélyezési Intézményében CMIM B—1856'. szálú alatt lététbe helyezett törzsét alkalmazzuk. À fenti törzset (ideiglenes elnevezése: Escherichia coli. WNII Genetika M—1) az Escherichia coli WNÍÍ* Genetika VL 334 (pYN7) törzs természetes mutációja alapján szelektálták. À kiindulási törzset úgy nyerték, hogy az L-treonin termeléséért felelős mutáns-géneket fokozott mértékben beépítették a vonatkozó gének hordozójának szerepét betöltő hibrid-plazmidokba. A törzset penicillin jelenlétében tenyésztjük. A mikroorganizmus penicillin-rezisztenciáját a plazmidok határozzák meg. Előnyösen 0,1—0,5 " g/1 jpenicíllinf1 adunk á'kiindulási tápkőzeghez. Ezen intézkedés következtében több tápanyagot tartalmazó, dúsabb közeget használhatunk a fermentációhoz, így a kezdő (nem-termelő) szakasz időtartamát csökkenteni tudjuk, ugyanis a dúsabb tápközegberi a tenyészet növekedési sebessége közel egy nagyságrenddel nagyobb anélkül, hogy a termelő törzs tulajdonságai lényegesen megváltoznának. Â kíindulásY’tápközeg feldúsítására savval vagy fermentációs'utón hidrolizált élesztőt vagy élesztŐr^UtfflzátÜmÖt adagolunk 1—5 g élesztő-szárazsúiy/litef mennyiségben. A szén- és nitrogén-koncentráció, valamint a pH érték optimális betartása érdekében a tenyésztés során többször is adagolunk olyan elegyet a tenyészléhez, amely szénforrást és vizes ammóniaoldatot tartalmaz. A találmány szerinti eljárásban termelő törzsként az É. coli WNII Genetika M—1 jelű törzset alkalmazzuk. Ez a törzs az E. coli WNII Genetika VL 334 (p YN7) természetes mutációja" során jött létre. Az E. coli WNII Genetika VL 334 jelű törzset à genetikái technika szokásos módszereivel az E. coli WNII Genetika MG—442 jelű törzsből állították elő az alábbiak szerint: Az E. coli WNII Genetika MG—442 donortörzs eúzinjei (á thr A jelű gén termékei) a mutáció következtében rezisztensek a treonin inhibitáló hatásával szemben. A fenti donortörzs kromoszómájának a Hind III. jelű endonukleáz segítségével kapott DNS-fragmense pedig a treonin-operon összes génjét tartalmazza. Az említett DNS-fragmenst a DNS-vektormolekulaként alkalmazott pBR 322 jelű plazmidokkal hibrid-plazmiddá egyesítették. A hibrid-plazmid molekulasúlya 11,4 megadalton (egy dalton = 1 hidrogénatom tömege = l,67xHTZ4 g), alkotórészei a pBR 322 plazmid két másolata és a donor-törzs kromoszómájának fent említett DNS-fragmense. A hibrid-plazmidokat a Hind III és Bam Hl jelű endonukleázokkal kezelték, és az így kapott frangmenseket polinukleotidlágázzal kezelve újra egyesítették. Az így kapott hibrid-plazmid 5,7 megadalton mólsúlyú, a pBR 322 plazmid egy molekulájából és a fenti DNS- fragmensből áll. Ez a plazmid a mikroorganizmus sejtjeit rezisztenssé teszi a penicillinnel szemben. A plazmidok a logaritmikus növekedés szakaszában 40—50 másolat mennyiségben képződnek a sejtben. Az E. coli VL 334 recipiens törzs mutációja abban van,'hogy a sejtekben az L-treonin és izoleucin szintézise blokkolt. Az izoleucin-szintézis gátlása nem teljes, ha a sejt több treonint tartalmaz, az izoleucin-szintézis gátlása megszűnik. A fenti recipiens törzset a hibrid-plazmidokkal transzferálták, így nyerték az E. coli WNII Genetika VL 334 (pyN7) törzset, amely L-treonint termel, A törzset a; Szövetségi Genetikai Kutató Intézet Mikfobiológiai Letétbehelyezésr Intézményénél CMIM B—1684. szám alatt letétbe helyezték. Az E. coli WNII Genetika VL 334. sz. törzset agart tartalmazó' táptalajra; oltották ; "'nagyon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65* 2
