180566. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-tronin előállítására mikrobiológiai úton
5 180 566 6 sok telepet vizsgáltak meg abból a Szempontból , hogy a mutáns termel-e L-treonint, tenyészthető-e minimális (csak glukózt és sókat tartalmazó) táptalajon és továbbÖrokíti-e a plazmidokat a fermentáció során. így izolálták végül az E. coli WNII Genetika M—1 jelű törzset, amelyet a találmány szerinti eljárásban alkalmazunk. A törzs jellemzői az alábbiak: Morfológia: gram-negatív, enyhén mozgékony, vékony pálcikák, végük gömbölyű, hosz'szuk 1,5—2 úm. Fiziológiai és tenyésztési jellemzők: Hús-pepton-agar : 37 °C-on 24 órás növekedés titán kör alakú, fehér,'félig átlátszó, 2—3 mm átmérőjű'telepek. A' téîëpek felületé sima, szélük simá vagy enyhén hullámos, központjuk kiemelkedik. Ä telepek állaga homogén, pasztaszerű, könnyen emülgálható. Agár- és glukóz-tartalmú minimálközeg (Adams szerint). 37 °C-on 2 napig tenyésztve szürkés-fehér, kor alakú, 1—1,5 mm átmérőjű, enyhén domború telepeket képez; szélük sima, belső szerkezetük homogén. A telepek felülete fényes. 4—5 nap múlva a telepek nyálkássá válnak. ■ Hús-pepton-lé 37 °C-on 24 órán át folytatott tenyésztés után a tenyészlé erősen zavarossá válik, kis mennyiségű csapadék képződik. Jellegzetes szag. Adams-féle folyékony ásványi tápközeg 37 °C-on levegőztetés mellett 2 napon át folytatott tenyésztés után erős zavarosság. A törzs a zselatint nem folyósítja, tejen jól növekszik, koagulációt idéz elő, indolt képez. A különböző szénhidrátok közül jól növekszik glükóz, laktóz, mannóz, galaktóz, xilóz, fruktóz, glicerol és mannitol jelenlétében sav- és gázképződés mellett. ■ Az antibiotikumok közül péhicillinnel szemben ellenálló. A törzs nem pátogén. ' Plazmid-fartalom ‘ A logaritmikus növekedés szakaszában a sejtek a pYN7 plázmid (mólsúly: 5,7 megadalton) 40—50 másolatát tartalmazzák. E plazmád a tréonin-opéroh génjeinek hordozója, és a penicillinnel szembeni ellenállóképésséget biztosítja. Növekedéshéz szükséges anyagok A törzs glukózt és ásványi sókat tartalmazó minimális közegben növekszik (generációs idő 240 perc). Izoleucin stimulálja a növekedést (generációs idő 60 perc). Élesztő savas-, vagy enzimes-hidrolizátumával dúsított tápközegben a generációs idő 30—40 perc.' Az E. coli WNII Genetika VL 334 (pYN7) kiindulási törzstől a következőkben különbözik: telepeinek a felülete • nyálkás, treonin-termelő képessége nagyobb, tápanyagadalékokat tartalmazó közegekben a stabilitása (a képessége, hogy fő tulajdonságait — treonin-termelés és a penicillin-rezisztencia — megtartsa) nagyobb. Ezeket a különbségeket az alábbi táblázatban foglaljuk össze. Törzs Azoknak a sejteknek a mennyisége (%), amelyek tenyésztés után tulajdonságaikat megtartották Glukózt és sókat tartalmazó közeg Huspepton-lé E. coli WNII Genetika VL 334 (pYN7) 72— 98 2—42 E. coli WNII Genetika M—1 88—100 82—98 A tenyésztést rázóasztalon 37 °C-on a megadott tápközegekbeh' végezzük. A 10. generáció után Höttinger-félé agar-húslével töltött edényékbe visszük át á mikroorganizmust elkülönült telepek nyerése céljából. Mindegyik kísérletben legalább 100 telep penicilíin-rezisztenciáját és tréóhin-térmelő képességét vizsgáljuk meg. A táblázatból kitűnik, hogy glukózt és ásványi sókat tartalmazó közegben végzett tenyésztés esetén mindkét törzs majdnem azonos mértékben tartotta fenn a képességet treonin termelésére, tehát e között a körülmények között a két törzs állandósága azonos. Tápanyagokban dús közegben (hús-pepton-lé) végzett tenyésztés esetén azonban az új törzs, az E. coli WNII Genetika M—1 sokkal nagyobb mértékben tartja meg tulajdonságait, mint a kiindulási törzs. Az új törzs feldúsított tápközeg esetén állandóbb. A törzs ezen állandósága, valamint (a hibrid-plazmidok okozta) penicillin-rezisztenciája lehetővé teszi, hogy a tápközeghez penicillint és a mikroorganizmus növekedését erősen fokozó tápanyagokat adagolhassuk a közeghez. Az E. coli WNII Genetika M—1 törzs generáció ideje a glukózt és ásványi sókat tartalmazó közegben 240 perc, a feldúsított közégben 30—40 perc. A nagy növekedési sebesség következtében a lombikokban és oltókészülékekben ^ végzett oltó'àriÿà'g-készités: feleslegessé válik, és á fermentáció időtartama csökkenthető. A tenyésztést az alábbiak szerint hajtjuk végre. Az E. coli WNII Genetika M—1 mikroorganizmus oltóanyagát agar-tartalmú, 500 y,g/ml penicillint tartalmazó minimális táptalajon 40— 50 órán keresztül tenyésztjük, utána a ferde aga'r felületéről a sejtekre fiziológiai konyhasóoldattal leöblítjük. A kapott sejt-szuszpenzióval a fermentációs közeget oltjuk be. A sejtek kezdő koncentrációja 2—5X103—107 sejt/ml lehet. A kiindulási tápközeg glukózt, ásványi nitrogént, sókat és penicillint, valamint tápadalékokat tartalmaz. Tápadalékként például fehérjehidrolizátum, így az élesztő savval vagy enzimekkel nyert hidrolizátumai és autolizátumai alkalmazhatók. A közeg pH értékét 7,0 és 7,2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
