180539. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amino-szuberinsavat tartalmazó kalcitoninszerű új polipeptid előállítására
g 18D539 10 Példa: ,----------(ch2)5---------------! CO-Gly-Aan-Leu - Ser-Thr - XHCHCO-Met-Leu- Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Aan - Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro - Gin -Thr - Ala-Ile - Gly - Val - Gly - Ala -Pro-NH2 előállítása. 2,0 g (0,6mmôl) BOC-Thr(Bzl)-Tyr[Bzl(Cl2)]-Thr (Bzl)-Gln-Asp (OBzl) -Phe-Asn (ClCbz)-Phe-His-Thr (Bzl) - Phe-Pro- Gln-Thr (Bzl) - Ala-Be - Gly-Val - Gly-Ala-Pro-NH2-t feloldunk 10 ml TFA-ban —5 °C- on. Szobahőmérsékleten 30 percig keverjük, majd az oldatot vákuumban bepároljuk, és etil-acetátot adunk hozzá, amitől csapadék keletkezik. A csapadékot nátrium-hidroxid felett szárítjuk. A megszárított csapadékot feloldjuk 10 ml DMF-ban, és hűtés közben trietil-amin hozzáadásával 9-re állítjuk a pH-t. Az oldathoz vizet adunk, amelytől csapadék válik ki. A csapadékot foszfor-pentoxid felett megszárítjuk, így a BOC-mentesvegyületet nyerjük szabad bázisként. 0,8 g (0,71 mmól) !-------------------(ch2)3-------------------—CO-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-HXCHCOMet-Leu-Gly-OH-t feloldunk 5 ml DMF : X- metil-pirrolidon (1:1) elegyben. Hozzáadunk 0,122 g HOSU-t és ezt követően hűtés közben 0,146 g DCC-t 3 ml DMF-ban oldva, majd éjszakán át keverjük. A reagáltatás után a csapadékot eltávolítjuk, és a kapott oldathoz hozzáadjuk az előbbiekben nyert BOC-mentes szabad bázist és 0,100 g HOBT-t, és 5 napig 30 °C-on keverjük. A reagáltatás után vizet adunk hozzá. A keletkezett csapadékot kiszűrjük, vízzel mossuk, majd megszárítjuk, így 2,6 g j-------------------(ch2)5------------------------! CO-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr-(Bzl)HXCHCO-Met- Leu-Gly-Thr(Bzl)-Tyr[Bzl(Cl2)]-Thr(Bzl)-Gln-Asp (OBzl)-Phe-Ans-Lys(ClCbz)-Phe-His-Thr(Bzl)-Phe- Pro-Gln-Thr (Bzl ) - Ala-Ile-Gly-V al-Gly-Ala-Pro- NH2-t kaptunk nyerstermékként. A fenti nyerstermék 1,0 g-ját 25 ml hidrogénfluoriddal, 0,1 g metioninnal és 2 ml anizollal elegyítjük —5 °C-on, és 60 percig szárazjég-metanol hűtőfürdőben tartjuk csökkentett nyomáson dimetil-szulfid jelenlétében. A hidrogén-fluorid eldesztillálása után a maradékot dietil-éterrel mossuk, és a csapadékot háromszori dekantálással tisztítjuk, majd 30 ml ecetsav és 10 ml víz elegyében oldjuk. Az oldatot átengedjük acetát-formájú Dowex 1x2 ioncserélő gyantával töltött 2,5 X8 cm méretű oszlopon, 200 ml vízzel mossuk, és az eluátumot ismét átengedjük egy 2,5x7 cm méretű HP—20 oszlopon. Az oszlopon 80%-os etanol oldatot engedünk át, és az eluátumból eldesztilláljuk az etanolt, majd az oldat liofilizálásával 0,440 g port kapunk. Ezt a 0,440 g port 0,01 mólos vizes ammónium-acetát oldatban oldjuk, és egy 2,2x25 cm méretű CM-cellulózzal töltött oszlopra töltjük, és 0,01—0,2 mólos ammónium-acetát oldattal (750—750 ml) (pH 4,5) lineár gradiens módszerrel eluáljuk. Az eluálásnál 10 g-os frakciókat szedünk, és a hatóanyagtartalmú frakciókat (67—70. frakciók) egyesítjük, és fagyasztva szárítással kapjuk a hatóanyagtartalmú port. A liofilizátumot 1 mólos ecetsavban oldjuk, és egy 2,2x137 cm méretű Sephadex LH—20 töltetű oszlopon kromatografáljuk 1 mólos ecetsavval eluálva. Az eluátumot 6 g-os részletekben szedjük, majd a hatóanyagot tartalmazó frakciókat (28—37.) egyesítjük, és liofilizáljuk. A liofilizátumot feloldjuk butanol: ecetsav: víz (4:1:5) elegy felső fázisában, és az oldatot átengedjük egy 2,7 x52 cm méretű oszlopon, amely az előbbi oldószerelegy alsó fázisával nedvesített Sephaclex G—25-tel van töltve, és utána az illető elegy felső fázisával van átmosva. Az eluálást ugyanezen oldószerelegy felső fázisával végezzük, és 6 g-os frakciókat szedünk, majd a hatóanyagot tartalmazó frakciókat (5—14,) egyesítjük, és liofilizáljuk. Az így kapott port hasonló körülmények között Sephadex G—25-ön újra kromatografáljuk, és liofilizáljuk. A liofilizált port 1 mólos ecetsavban oldjuk, egy 2,2x137 cm méretű, Sephadex LH—20 töltetű oszlopra töltjük, és 1 mólos ecetsavval eluálva 5 g-os frakciókat szedünk. A hatóanyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és liofilizálva 29,7 mg terméket kapunk acetát alakjában (1000 MRC egység/mg). Rf = 0,82 [hordozó: Merck cellulóz; eluálószer: n-butanol: :ecetsav:víz (4:1:5) (felső fázis)]. [*]** =—69,6° (c = 0,72; 1 mólos ecetsav). Az aminosavanalízis eredményei [talált (számított)]: Lys 1,15 (1), His 1,01 (1), Asp 2,94 (3), Thr 4,80 (5), Ser 1,06 (1), Glu 2,14 (2), Pro 1,96 (2), Gly 4,00 (4), Ala 2,00 (2), Val 0,95 (1), Met 0,87 (1), Ile 0,96 (1), Leu 1,84 (2), Tyr 0,96 (1), Phe 3,18 (3), a-amino-szuberinsav 1,02 ((1). A gyűrűzárást a következő módon végezzük: 2,8 g BOC-Gly-Asn-Leu-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-NH(CH2)5—COOH-CHCOOHa 30 ml vízmentes piridinnel készült oldatához 5 g trifluor-ecetsav-o- nitro-fenilésztert (TFA—ONP ) adunk, és 3 óra hosszat 45 °C-on keverjük. A reakció befejeződése után az elegyet vákuumban bepároljuk, a maradékhoz dietilétert adunk, a csapadékot kiszűrjük, és dietiléterrel mosva 2,8 g pnitro-fenilésztert kapunk barna por alakjában. A kapott porszerű termékhez hűtés közben 15 ml trifluorecetsavat adunk, 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd a trifluorecetsavat ledesztilláljuk. A maradékot 20 ml dimetilformamidban feloldjuk, hozzácsepegtetjük 3,0 liter vízmentes piridinhez, és 1 óra hosszat 45 °C-on keverjük. Ezután a reakcióelegyet 8 óra hosszat 50 °C-on, majd éjszakán át 40 °C-on keverjük. A reakcióelegyet vákuumban 200 ml-re bepároljuk, 3 óra hoszs'/.at 40 °C-on keverjük, majd vákuumban 50 ml-re 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
