180539. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amino-szuberinsavat tartalmazó kalcitoninszerű új polipeptid előállítására

7

180539

8

csoportokat az előbbiekben leírt módszerrel, előnyösen savas bontással, például hidrogén-fluoriddal hasítjuk le, és így kapjuk végül az (I) képletű peptidet.

A jelen találmány szerinti új polipeptidnek a Merrifield-féle szilárdfázisú peptidszintézis-módszerrel végzett szintézisében a szerinben és treoninban levő hidroxicsoportot például benzilcsoporttal védhetjük, és a tirozinban levő hidroxicsoportot diklór-benzilcsoporttal ; a hisztidinben levő iminocsoport- például l-(benziloxi-karbonil-amino)-2,2,2-trifluor-etilcsoporttal védhető ; és a glutaminsav oldallánca például benzilészter. csoporttal Az a-aminocsoport védőcsoportja például terc-butoxi-karbonil-, o-klór-benziloxi-karbonil- vagy o-bróm-benziloxi-karbonil-csoport.

A védett peptidet a hordozó gyantáról és a védőcsoportot vízmentes hidrogén-fluoriddal távolítjuk el.

Az összes védőcsoport trifluor-ecetsavval végzett hidrolízis útján történő egylépéses eltávolítása akkor alkalmazható, ha aminocsoport védésére tercbutoxi-karbonilcsoportot, az oldallánc karboxilcsoport védésére terc-butil-észter csoportot, a szerinben, treoninban és tirozinban lévő hidroxilcsoport védésére terc-butil-éter csoportot és a hisztidinben levő imino-csoport védésére 2,2,2-trifluor-l(terc-butoxi-karbonil-amino)-etilcsoportot használunk.

A jelen talulmány szerinti (I) képletű új polipeptid szabad bázis formájában vagy valamilyen sóként nyerhető. A szabad bázis szokás szerint sójából is megkapható. A szabad bázis gyógyszerészetileg elfogadható savaddíciós sóvá alakítható valamilyen szervetlen savval, így sósavval, brómhidrogénsavval, kénsavval vagy foszforsavval, vagy valamilyen szervetlen savval, például hangyasavval, ecetsavval, propionsavval, glikolsavval, tejsavval, piroszőlősavval, oxilsavval, borostyánkősavval, almasavval, citromsavval, borkősavval, benzoesavval, szalicilsavval, valamilyen rövidszénláncú alkánszulfonsavval, benzoesavval vagy toluolszulfonsavval reagáltatva.

Az új polipeptid különböző szervetlen vagy szerves anyagok hozzáadásával valamilyen komplexévé alakítható. Az illető komplex forma valamilyen fajta szervetlen vagy szerves anyagnak a hosszéi láncú polipeptidhez történő hozzáadásával képződik, és a komplex adagolásakor hosszú ideig tartó hatást eredményez. Az említett komplexképző anyagokra példák kalcium, magnézium vagy cink szervetlen vegyületei, különösen az illető fémek foszfátja, pirofoszfátja vagy polifoszfátja. Az említett komplexképző szerves anyagokra további példák a nem-antigén hatású zselatin, karboximetil-cellulóz, alginsav szulfonsav-észtere vagy foszforsav-észtere, dextrán, polialkoholok, poliglutaminsav, protamin vagy hasonlók.

A találmány leírása során használt rövidítések jelentése az alábbi:

BOC: terc-butoxi-kar- AOC: terc-amiloxibonil csoport, -karbonilcsoport,

Cbz:

benziloxi-karbo- CICbz :

o-klór-benzilnilcsoport,

oxi-karbonilcsoport,

Bzl:

benzilcsoport, Tos :

tozilcsoport,

Bzl(Cl2):diklór- OEt: benzilcsoport,

etoxicsoport,

OBu :

terc-butoxi- OBzl :

benziloxicsoport,

csoport,

ONP:

p-nitro-fenoxi- OSU :

N-hidroxicsoport,

szukcinimidocsoport,

Ser:

L-szerin, Asn :

L-aszparagin,

Leu:

L-leucin, Thr :

L-treonin,

Val:

L-valin, Pro :

L-prolin,

Arg:

L-arginin, Asp :

L-aszparaginsav,

Ala:

L-alanin, Gly:

glicin,

Lys:

L-lizin, Gin :

L-glutamin,

Glu:

L-glutaminsav, His:

L-hisztidin,

Tyr:

L-tirozin, Met :

L-metionin,

Phe:

L-fenilalanin, Ile:

L-izoleucin,

TFA:

trifluor-ecetsav, TosOH-p-toluolszulfonsav,

CHA:

ciklohexilamin, DCHA :

diciklohexilamin,

THF:

tetrahidrofurán, DMF :

dimetil-formamid,

AcOEt :

etil-acetát, DCC:

diciklohexilkarbodiimid,

WSC:

N-etil-N’-(dimetil-amino-propil) - karbodiimid,

HOSU:

N-hidroxi-szuk- HOBT:

1-hidroxicinimid,

benztriazol,

MeOH :

metanol, EtOH:

etanol,

AcOH:

ecetsav, BuOH:

butanol,

HMPA

hexametil-fosz-forsav-triamid.

A következő példák szemléltetik a találmányt, de nem korlátozzák annak oltalmi körét az igénypontokban meghatározott oltalmi körhöz képest.

A szérum kalciumszint csökkentő hatás meghatározására szolgáló módszer, a vékonyrétegkromatográfia hordozó és a kifejlesztő rendszer, valamint az aminosavanalízis körülményei az alábbiak:

Meghatározási módszer :

A mintát 0,1% albumint tartalmazó 0,1 n nátrium-acetát oldattal hígítjuk. Az illető hígított oldatokból 0,2 ml-es adagokat adunk intravénás injekcióként hím patkányoknak. Egy óra elteltével valamennyi patkányt leöljük, megfelelően kinyerjük vérüket, és az egyes vérminták szérum kalcium-szintjét atomabszorpciós spektrofotometriával meghatározzuk. Standard görbe felvételére standard lazac-kalcitonint használunk, amelyet a National Institute for Biological Standard and Control bocsát rendelkezésünkre. A megfelelő standard hatásából határozzuk meg a mintában levő kalcitonin hatásosságát.

Aminosavanalízis :

A mintát 6 n sósavoldatban (amelyhez néhány csepp anizolt adunk) 110 °C-on 45 órát hidrolizáljuk, és csökkentett nyomáson megszárítjuk, majd ezután vetjük alá aminosavanalízisnek.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

4