180539. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amino-szuberinsavat tartalmazó kalcitoninszerű új polipeptid előállítására
5 180509 6 vagy a Geiger-módszer. A kondenzációs reakcióban a racemizáció gondosan kerülendő. Az így kapott pepiidben az alábbi szerkezeti egységet tartalmazó részt (CH,)*—COOR H—G1 y-Ans-Leu-Ser-Thr-NHCHCO— amelyben R. az előbbivel azonos jelentésű — gyűrűzárásra késztetjük. A gyűrűzárási reakció az a-aminoszuberinsavban levő aktivált co-karboxilcsoport és az N-terminális aminosavban levő szabad aminocsoport közti kondenzációs reakció útján megy végbe. A kondenzációs reakcióban a szerin és a treonin hidroxilcsoportja alkalmasan védendő. A találmány szerinti előnyös eljárás kivitelezése egy a-amino-szuberinsavat tartalmazó (tetszés szerint védett aktív csoportokkal rendelkező) peptidgyűrű és a tetszés szerint védett aktív csoportokat tartalmazó fennmaradó másik peptidrész kondenzációs reakciója útján történik. Vagyis az 1-től 6—9-ig terjedő aminosavat tartalmazó N-terminális fragmenst kondenzáljuk a fennmaradó 7—10- től 31-ig terjedő aminosavakat tartalmazó peptiddel. A két fragmens reaktivitásának fokozása és a kondenzáció során a racemizáció elkerülése céljából előnyösen glicint alkalmazunk C-terminális aminosavként. A jelen találmányban előnyös, hogy az 1—9. aminosavig terjedő szekvenciarészt tartalmazó pepiidet reagáltatjuk a 10—31. aminosavig terjedő szekvenciarészt tartalmazó peptiddel. Az említett kondenzációs reakció kivitelezhető szabad terminális karboxilcsoportot tartalmazó peptidből kiindulva az úgynevezett Wiinsch-féle módszerrel vagy aktív észteres módszerekkel. Kivitelezhető előnyösen terminális azid- vagy hidrazid-csoportot tartalmazó peptidből kiindulva az azidos módszerrel is, vagy a vegyes anhidrides módszerrel is. Az N-terminális fragmens, azaz az 1-től 9-ig terjedő aminosavszekvencia-részt tartalmazó nonapeptid szintézisét részletesen bemutatjuk a következőkben, azonban az 1—6 hexapeptid, az 1—7 heptapeptid vagy az 1—8 oktapeptid is lényegében hasonló eljárással állítható elő. A nonapeptid szekvenciarész a C-terminális aminosavtól kiindulva az egyes aminosavaknak 2—4 aminosavból álló kisebb peptiddel az aminosavszekvencia sorrendjében történő kapcsolásával állítható elő. Az aminosavat, például glicint, leucint, a-amino-szuberinsavat, treonint, metionint, szerint vagy aszparagint előnyösen az aktív észteres módszerrel kondenzáljuk. A kisebb pepiidet, például a 2—4-tripeptidet előnyösen a Geigermódszerrel vagy a Wiinsch-módszerrel kondenzáljuk. Az azidos, az aktív észteres vagy a savanhidrides módszerrel végzett kondenzációs reakcióban nem szükséges védeni a terminális karboxilcsoportot a nonapeptidben. A karboxilcsoport azonban védhető alkoholokkal, így metanollal, benzil-alkohollal vagy más alkoholokkal történő észterezéssel is. Az észtercsoport, például a metilészter híg nátriumhidroxid oldattal vagy hidraziddá történő átalakítással távolítható el, míg a benzilészter csoport katalitikus hidrogénezéssel. A köztitermék aminocsoportja valamilyen szokásos védőcsoporttal, például benziloxi-karbonil-, tritil-, terc-butoxikarbonil-, vagy 2-(p-difenil)-izopropoxi-karbonilcsoporttal védhető. A karboxilcsoport szükség esetén szokásos észterezéssel védhető. A szerinben és treoninban levő hidroxilcsoport szükség esetén éterképzéssel védhető, például terc-butil-, benzilvagy egyéb csoporttal. A benziloxi-karbonil-, p-nitro-benzil-észter és benzil-észter csoportok katalitikus hidrogénezéssel hasíthatok palládiumosszén katalizátor jelenlétében. Az N-tritil-csoport vizes ecetsavval, a terc-butoxi-karbonil-csoport trifluor-ecetsavval hasítható le. Az o-nitro-fenil-szulfenil-csoport szerves oldószerben hidrogén-kloriddal, hidrogén-eianiddal vagy kénessavval hasítható le. A difenilizopropoxi-karbonil-csoport ecetsav : hangyasav : víz (7:1:2) eleggyel hasad le. A metil-észter, etilészter vagy p-nitro-benzil-észter hidrazin-hidráttal hidraziddá alakítható. A metil-észter csoport híg nátrium-hidroxid oldattal távolítható, el, míg a terc-butil-észter trifluor-ecetsavval hasítható. A 7—-10-től 31-ig terjedő aminosavszekvenciát tartalmazó C-terminális pepiidet, amelyet az előbbi N-terminális peptiddel kondenzálunk, előnyösen a C-terminális aminosavnak (a 31. aminosavnak) vagy a C-terminális fragmensnek, például a 30—31., 28—31., 25—31., 24—31. vagy 23—31. aminosavszekvenciát tartalmazó peptidnek egyes aminosavakkal vagy 2—4 aminosavból álló kisebb peptidekkel az előbb megadott aminosavszekvenci a szerinti sorrendben történő kapcsolásával szintetizáljuk. A 10—31. C-terminális fragmens például aminosavak és kisebb peptidek, így a 30—31. vagy a 28—29. dipeptid, a 25—27. tripeptid, a 23—24. dipeptid, a 21—23. tripeptid, a 16—19. tetrapeptid és a 10—15. hexapeptid a C-terminálistól kiindulva az aminosavszekvencia sorrendjében végzett kondenzációjával építhető fel. Előnyös védőcsoportok az egyes csoportok részére: a-aminocsoporthoz terc-butoxi-karbonil-csoport; glutam insav oldalláncban lévő karboxilcsoportjához benzilcsoport riízin s-aminöcsöportjához o-klór-benziloxi-karbonil-csoport; szerin és treonin hidroxilcsoportjához benzilcsoport ; tirozin hidroxilcsoportjához diklór-benzilcsSport ; hisztidin iminocsoportjához tozil csoporti/" T"T" Az előbbiekben említett valamely védett a-aminocsoporttal rendelkező 7—10-től 31-ig terjedő C-terminális fragmens, például a 10—31. szekvenciának megfelelő dokozapeptid-amid védőcsoportját alkalmas módszerrel eltávolítjuk. A tritilcsoportot például vizes ecetsavval hasítjuk le. A difenil-izopropoxi-karbonil-, benziloxi-karbonil- és tere-butoxi-karbonil-csoportokat ecetsav, hangyasav, és víz elegyével; hidrogénezéssel illetve trifluor-ecetsavval távolítjuk el. így a védett e-aminocsoporttal, védett a-aminocsoporttal, tetszés szerint védett karboxil-oldallánccal és/vagy hidroxil-oldallánccal rendelkező hentriakontapeptid-amidot kapjuk. Erről a védő5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
