180484. lajstromszámú szabadalom • Eljárás stabil, nagy mértékben immunogén, egy/vagy két jellemzőjében mutált, legyengített salmonella-baktérium mutánsok előállítására élő oltóanyagokhoz

13

180 484

14

2. példa

Két jellemzés mutánsok

A szaporodást nem gátló módon legyengített kiindulási törzsekből (vagyis egyjellemzős mutánsokból) levezetett purin-dependens kiónok, amelyek a purin-dependenciára vonatkoztatva 107 purin-dependens csírára legfeljebb 1 prototrof íeveitáns reverzió-gyakoriságot mutatnak, két egymástól függetlenül legyengítő jellemzés potenciális oltótörzsként alkalmazhatók.

A két jellemző kapcsolása:

1. jellemző pl. :

— metionin- vagy hisztidin-auxotrofia-nrutánsok, ko-mutáció által megbatározott legyengítessek A vitulenciához történő reverzió gyakorisága <10"7, legalább 20 ágár-tápközegen való passzázs általi stabil legyengítessél, a legyengített mutánsokat i. p. 105 és 107 mutáns-csírával beoltott egereken kimutatva; ezek közül az egerek közül egyesek interkurrens fertőzés vagy az oltótörzzsel történő terhelés következtében elhullanak (a vadtörzs i. p. LD^ értéke: 106’5 csíra) ;

— az R-formájú mutánsok, amelyek reverziógyakorisága: < 10"8.

2. jellemző:

— purin-fiiggőség, < 10"7 reverzió-gyakorisággal ; ez a gyakorlati körülmények között elhanyagolható <10"14 össz-reverzió-gyakoriság (lásd fentebb) folytán gyakorlatilag teljes stabilitást biztosít.

Az oltótörzseknek a legyengítő jellemző egyike tekintetében bekövetkező, csupán elméletileg szóbajövő revertánsok a populációs szinten biztonsággal kiküszöbölődnek, már csak azért is mert az ilyen revertánsok a másik jellemző tekintetében még mindig le vannak gyengítve.

A fent leírt módszerrel a leírt Salmonella kétjellemzős oltótörzseket oly alakban kapjuk, amelyben a purin-fiiggőség szerepel második, a szaporodást nem gátlóan legyengítő jellemzőként.

A legyengített purin-dependens egyjellemzős mutánsokból kiindulva másképpen auxotrof (például tiamin-auxotrof) kiónok is nyerhetők, amelyeknek erre a második jellemzőre vonatkoztatott reverzió-gyakorisága <10"7, és amelyek két egymástól függetlenül legyengítő jellemzőjű potenciális oltótörzsekként jönnek tekintetbe.

Ebben az esetben a jellemzők a következők:

1. jellemző:

purin-dependcncia, < 10"7 reverzió-gyakorisággal;

2. jellemző:

például tiamin-auxotrófia, legyengítessél és <

10-7 prototrofiához való reverzió-gyakorisággal.

A kétjellcmzős oltótörzsek különleges jellemzőit a következő három példa szemlélteti :

2a. példa

Salmonella dublin (81) pur[ade]"tia"

1. jellemző :

pur[ade]_, a prototrofiához való reverzió gyakorisága: 10"8; i. p. LD50 egéren: 108’5 csíra.

2. jellemző:

tia", a prototrofiához való reverzió: ~10"a tia csíra. S. dubhn (81) pur [ade]" tia" i. p. LD50 egéren: 10’’7 csíra [S. dublin (81) vadtörzs: i. p. LD50 egéren 101’2 * * * * csíra] Az oltótörzs,—S. dublin (81) puifade] "tia" — két jellemzőjének egyidejű visszamutálási gyakorisága így elméletileg a 10"16 nagyságrendnél is kisebb.

A Salmonella dublin(81) pur [ade]"tia"kétjellemzős mutáns-törzs in vivo stabilitását és perzisztenciáját, ugyanúgy, mint az LD60-érték és az immunogenitás vizsgálatát NMRT egereken vizsgáltuk. A Szerveket porcelán-mozsárban egyenként homogenizáltuk, majd ezt követően egy-egy 10 ml húsfőzet-tápközeget (SIFIX, Berlin-Weissensee) tarttalmazó kémcsőbe vittük. 37 °C hőmérsékleten történő 24 órai inkubálás után a húsfőzet-tápközegen szaporított kultúrákat módosított Gassnerféle táptalajra oltottuk és itt ismét 24 óra hosszat inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. Az így kapott kultúrákból több kolóniát Kligler-féle ferdeágárkémcsőre vittünk, 37 °C hőmérsékleten 24 óra hosszat inkubáltuk, majd a Salmonellára gyanús kultúrákat szerológiailag tipizáltuk. Az esetleg elkülönített revertánsok felismerése céljából a Kligler-kultúrákat részben vagy teljesen szubsztituált minimál tápközegre vittük a mutatkozó jellemzők meghatározása céljából.

Valamennyi vizsgált kultúra mindkét jellemzőt mutatta; a jellemzők in vivo reverziója nem volt tapasztalható.

A 2. ábrán az S. dublin (81) pur [ade]"tia" kétjellemzős mutáns esetében szemléltetjük a csírák kvalitatív kimutathatóságát az egerek a) vékonybelében és vastagbelében, illetőleg b) tüdejében, májában és lépében, 1010 csírával gége-szondán keresztül történő egyszeri orális terhelés után; a fertőzés utáni 8., 16., stb. napokon (a grafikon abszcisszáján) 4—4 egeret vizsgáltunk. A grafikon ordinátáján a kimutatott csíraszám van feltüntetve. Az adatok azt mutatják, hogy a szervekben való perzisztencia a parenchimás szervekben lényegesen jobban mutatható ki és hosszabb időtartamú is, mint a belekben. A bélből a csírák a fertőzés utáni

23. napon voltak utoljára kimutathatók, míg a parenchimás szervekben a kimutatás az 55. napig volt lehetséges. Az avirulens kétjellemzős mutáns ilyen időben korlátozott Szerv-perzisztenciája a nagyfokú immunitás elégésének egyik kívánatos tényezője. A Salmonella dublin (81) pur [ade]"tia" kétjellemzős mutáns törzs laboratóriumi állatokon mutatott immunogenitását a IV. táblázat adatai szemléltetik. A táblázaton bemutatott kísérletekben egereken vizsgáltuk az orális immunizálás hatását kétszeres immunizálás esetén az 1. és 14. napon, négyszeri immunizálás esetén pedig az 1.,

2., 3. és 14. napon történt az antigén-beadás. Az

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7