180306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarkozin-oxidáz előállítására
180.306 mégha tározásával. 6. ábra: Szarkozin mennyisági elemzése a termelt hidrogén-peroxld meghatározásával. A találmány szerinti eljárás egyik megvalósításában a Bacillus sp, B-0Ő18 FERM-P k0k9 törzset az antibiotikum vagy enzimtermeléshez szokásosan használt táptalajon tenyésztjük. Az ipari termeléshez előnyös a süllyesztett, levegőztetett tenyésztés. Előnyösen használhatjuk a mikroorganizmusok tenyésztésére szokásosan alkalmazott táptalajokat. Nitrogénforrásként asszimilálható nitrogénforrásokat, például kukoricalekvárt, szójalisztet, húskivonatot, élesztőkivonatot, ammóniumszulfátot, ammóniumlcloridot stb. használhatunk. Asszimilálható szénforrásként előnyösen például glükóz, melasz, kemény!tő-hidrolizátum stb. alkalmazható. Adott esetben különféle szervetlen sók, például nátrium-klórid, káliumklorid, magnéziumszulfát, kálium-hidrogénfoszfát vagy kálium-hidrogénfoszfát is használható, A táptalajhoz előnyösen 0,5-1,0 $ mennyiségben kreatint adva, a szarkozin-oxidáz termelését serkenthetjük. A tenyésztés hőmérséklete a sejtek növekedésétől, és az enzimtermeléstől függő határok között, előnyösen 26 és 33 °C között lehet. A tenyésztés időtartamát a körülményektől függően lehet változtatni, de rendszerint ez 15-25 óra lehet. A tenyésztést természetesen akkor kell befejezni, amikor a szarkozin-oxidáz termelés lényegileg befejeződött. A szarkozin-oxidáz enzimet a mikroorganizmusok sejtjei tartalmazzák. A tenyésztés során kapott baktériumtömegből a szarkozin-oxidáz kivonását a következő módon hajthatjuk végre: A kapott, sejttömeget centrifugáljuk, a nedves sejteket pufferoldatban, például trisz-HCl oldatban szuszpendáljuk, és a sejtfalakat lizozimmel vagy ultrahanggal kezelve vagy franoiaprésen szakítjuk fel. Az igy kapott nyers szarkozin-oxidázt a proteinek és enzimek szokásos elkülönítési és tisztítási módszereinek vetjük alá. Például szükség esetén a nukleinsavat protaminszulfát hozzáadásával eltávolítjuk, majd acetonnai, metanollal, etanollal vagy izopropanollal frakoionált kiosapást végzünk, és az enzimet előnyösen ammóniumszulfáttal kisózzuk. A további tisztítást például kromatografálás segítségével végezzük úgy, hogy a nyers szarkozin-oxidázt trisz-HCl pufferban oldjuk, és anionoserélöket, például dietilamino-etil-oellulózt vagy -dextrángólt és gó1szűrőkét, például dextrángélt vagy poliakrilamid gélt használva kromatografálunk, A tisztított szarkozin-oxidáz liofilizált por alakjában tárolható, A találmány szerint előállított szarkozin-oxidáznak a következő fizikai-kémiai tulajdonságai vannak: (l) Enzimhatás Egy mól szarkozin oxidációban egy mól vizet és egy mól oxigént fogyaszt, és a reakcióban egy mól glioin, egy mól formaldehid és egy mól hidrogénperoxid keletkezik. Az enzim a szarkozin oxidációját glioin és formaldehid keletkezése közben katalizálja. ch3-nh-ch2-cooh + o2 + h2o ------> h2n-ch2-cooh + HCHo + h2o2 Az enzim meghatározását a következő módon hajtjuk végre: 0,05 ml 0,2 mólos trisz-HCl puffert (pH-Ja 8,0), 0,05 ml 3 mg/ ml konoentráoiójú U-amino-antiprint, 0,05 ml, 0,2 $-os fenolt, 0,05 ml. 0,5 mg/ml konoentráoiójú peroxidázt, 0,1 ml, 1 mólos 5
