180306. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarkozin-oxidáz előállítására
180.306 szarkozint 6s 0,2 ml desztillált vizet tartalmazó 0,5 ml reakoiókeverókliez hozzáadunk 10 ul enzimoldatot ás 5 percig: 37°C- on inkubál julc, majd a reakció megállapítására 2,5 ml etanolt adunk hozzá. A hidrogénperoxid keletkezését kolorimetriás módszerrel *»80 nm-nél végzett abszorpoiómérássel határozzuk meg. Az enzimaktivitás egységét (l egység) azon enzimmennyiségként határozzuk meg, ami percenként 1 umól hidrogénperoxidot fejleszt. (2) Fajlagos aktivitás 0,05 ml, 0,2 molos trisz-HCl puffert (pH-ja 8,0), 0,05 ml, 3 mg/ml koncentrációjú *+-amino-antipirait, 0,05 ml, 0,2 %-os fenolt, *0,05 ml, 0,5 mg/ml koncentrációju peroxidázt, 0,2 ml desztillált vizet és az alább felsorolt összehasonlító anyagok egyikének 0,20 ml, 0,5 mólos oldatát tartalmazó reakoiókeverékhez 0,5 egység szarkozin-oxidázt adunk, és 5 peroig 37°C-on inkubáljuk. majd a reakció megállítására 2,5 ml etanolt adunk hozzá, és 480 nm-nél kolorimetriás meghatározást végzünk. A különféle vegyületekkel szemben mutatott fajlagos enzimaktivitás a következő volt: Vegyület Fajlagos aktivitás szarkozin 100,0 kolin 0 bétáin 0,03 dimetilglioin 0,01 glicin 0,06 szerin 0 treonin 0 alanin 0 valin 0 lizin 0,09 N-metil-etanolamin 0 N-dimetil-etanolamin 0 (3) Opitmális pH Hogy elkerüljük a 4-amino-antiprin-fenol-peroxidáznak a kromogénre gyakorolt hatását, az eldehid keletkezését az aoetilaoeton módszerrel határozzuk meg. Az eredményeket az 1. ábrán szemléltetjük; az optimális pH 8,0-9,5. A meghatározásban a következő pufferoldatokát használtuk: k-7 pH-nál dimetil-glutarát puffert; 9-10 pH-nál glioin-NaOH puffert; és 10-11 pH-nál nátriumkarbonát-puffért, (4) Optimális hőmérséklet Amint a 2. ábrán látható, az optimális hőmérséklet 50°C körül van. Vizsgált vegyület: szarkozin. (5) pH-stabilitás 5-7 pH-nál dimetilglutarát puffert, 6-8 pH-nál foszfát puffert, 7»5-9 pH-nál trisz-HCl puffert, 9-10 pH-nál glioin-NaOH puffert és 10-11 pH-nál nátriumkarbonát-borát puffert - minden esetben 0,1 ml mennyiségben - használtunk. A 0,1 ml pufféroldathoz 100 yUl enzimoldatot (100 ug/ml protein) adunk, és 60 peroig 37 °C-on állni hagytuk. Ezután a pH-t 0,3 ml, 8,0 pH-jú 1,0 mólos trisz-HCl puffer hozzáadásával beállítottuk, és 20 /ul mintát vettünk, hogy meghatározzuk az >enzim aktivitását, Összehaaonlitő alapanyagként szarkozint használtunk. Amint a 3« ábrán látható, a stabil pH 6,0-10,0 között van. (6) Hőállóság 6
