180285. lajstromszámú szabadalom • Eljárás különböző poliszacharidéterek új aminoszármazékainak előállítására affinitáskromatográfia kárkészítés céljából
180.285 b a n 3 0;.' léin'ili- n» - oldására fejlesztették, ki, melyek a biológiai anyagokna y koncentrációban /10~/l - 10“^ M/ megtalálható komponen- 1:1 n;.oreaét célozták. Ezen cél érdekében széleskörűen elterjedt a bioapecifitást hordozó anyagok brómciánnal aktivált hordozókhoz közvetlenül, vagy különböző hosszúságú karokon keresztül való rögzítése. A nagy affinitásu fehérje-ligand kölcsönhatások, valamint az igen kis koncentrációjú /10-o - io”^ \\/ fehérjék /pl. vitamin-, és hormonreceptorok/ izolálása során azonban a dimenzióváltás miatt olyan problémák merülnek fel, melyek rávilágítanak az eddig jól bevált eszközök fogyatékosságaira, és igy eme feladatok megoldására csak kevéssé látszanak alkalmasnak. Esen fehérjék tisztítására affinitáskrómatográfiával, a téma jelentőségéhez képest, csak kisszámú publikáció jelent meg, melyek nagyobbik részét mindmáig sem igazolták. Mivel kísérleteink egy hasonló, igen kis koncentrációjú, és nagyon érzékeny celluláris szabályozofehér je? a glükokortikoid hormon receptor izolálását célozták, ezt a kérdést átfogóan megvizsgáltuk. A kereskedelemben kapható, erőteljes brómcianos aktiválással készített mátrixok jelentős hátránya, hogy a poliszacharid hordozón megjelenő anioncserélő csoportok miatt egy ioncsere szuperponálódik a biosçecif ik.ua kölcsönhatásra. Ez a kísérleti rendszerek egy részénél nem zavaró, vagy pedig nagy ionerősség alkalmazásával hatása eliminálhato. Az általuk tisztítandó fehérje kitünően kötődik anioncserélőkön és a nagy sókoncentráció melletti eluciója igen csekély eredménnyel jár. E- zen nehézség részben feloldható akkor? ha a mátrix szintézisét házilag végezzük egy kíméletes brómcianos aktiválással /Porath et al. /1973/ J. Chromatography 86, 53-56/, mely csak kismértékű karbevezetést eredményez, és igy a létrejövő ioncserélő csoportok száma is csekély. Ez azonban még mindig nem teszi lehetővé az optimális tisztítási körülmények létrehozását, nem beszélve arról, hogy még megmarad az igy készített karok másik súlyos fogyatékossága, nevezetesen a ligand lassú, de feltartóztathatatlan leazivárgása a mátrixról. Ez a tárolás és felhasználás körülményeitől függően különböző idő alatt megy végbe, és végül az affinitásgél spontán tönkremenetelét eredményezi. Olyan esetekben azonban, mikor a gélszintézis igen komplikált és igy speciális ismereteket igénylő, ez megengedhetetlen. Ebbe a kategóriába tartozik pl. a patkány máj glükokortikoid receptorának tisztítására /?• példa/ használt affinitásgélünk, melynek szintézise mintegy 8-10 nap munkát vesz igénybe, és emellett nagyszámú drága vegyszer felhasználásával jár. Ez arra késztetett bennünket, hogy olyan kar készítési módszert keressünk, mely kiküszöböli az előbb említett hiányosságokat. Ismeretes az irodalomból, hogy epoxlvegyületekkel poliszacharldokba éter kötésen át reaktiv oxirán csoportok vezethetők be, melyek továbbalakithatók tiol csoportokká /Axén et al. /1975/ Acta Chem.Scand. B29, 471-4-74/* vagy közvetlenül használhatók aminosavak, peptidek és fehérjék immobilizálására /Sundberg é3 Porath /1974-/ J. Chromatography 90. 87-98/* Az általuk közölt eljárások jellemzője az erősen lúgos reakcióközeg /0,6 - 2,5 M nátriumhidroxid/ a nagy epoxi.vegyület koncentráció, az egyes esetekben meglehetősen magas reakcióhőfok /60°C/ és a hosszú aktiválási idő. Ezen körülmények, a szerzők által /Sundberg és Porath/ is említett módon kiterjedt keresztkötéseket hoznak létre a mátrixon, jelentősen megváltoztatva annak eredeti 2
