179995. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a légzőszerven keresztűl beadható vakcina és késztmény előállítására
5 179995 6 (2) A függőcsepp módszerrel vizsgálva a D—1 és a B törzsek mozgékonyak, míg az 55. törzs gyakran nem mozgékony. (3) A módosított MacConkey-féle táptalajban az 55. törzs 0,02 mg/ml koncentrációjú Furatodone-ra érzékeny, míg a D—1 és B törzsek nem érzékenyek. (4) Simon-féle citrát-agar ferde lemezen az 55. törzs lassú és gyenge pozitív reakciót ad (24 óra), míg a D—1 és B törzsek 18—24 óra alatt erősen pozitív reakciót adnak. (5) A 3 törzs közül az 55. törzsnek legnagyobb a hemagglutináló titere. (6) Az 55. törzsnek két plazmódiuma van, az egyik 31 megadaltonos, a másik 3 megadaltonos. Ezenkívül a d2 sejthártyaprotein nagyobb mennyiségű, mint a többi törzseké, például a virulens B és virulens D—1 törzseké. Az 55. törzs elegendő számú élő sejtjeit a sertés orrjáratába juttatva, ezek ott szaporodnak, és az orrjáratok nyálkahártyáin telepeket alkotnak. A telepek csak néhány napig maradnak meg, és a sertés orrjárataiból rendszerint egy hétnél rövidebb idő alatt eltűnnek. Ha az 55. törzs sejtjeit kutyák orrjárataiba vagy egyéb légzőszervi járatainak nyálkahártyáira juttatjuk, a telepek előbb kialakulnak, majd eltűnnek. Kutyák esetében a telepek valamivel hosszabb ideig maradnak meg, csak néhány hét alatt tűnnek el. Az alatt az idő alatt, amíg az állatok légzőszervi nyálkahártyáin az 55. törzs telepei jelen vannak, ezek nem idézik elő a betegség klinikai tüneteit. Az állatok ellenállása a későbbi virulens Bordetella bronchiseptica fertőzés ellen viszont lényegesen megnövekedett. A helyi immunizálás meggátolja a fertőző Bordetella bronchiseptica növekedést, és nagymértékben gyorsítja a feltisztulás sebességét. A sertésekben meggátolja az agrófiás orrnyálkahártya-gyulladást és nagymértékben csökkenti az orrkagylócsont ezutáni sorvadását. Kutyákban meggátolja a tracheobronchitises köhögés klinikai tüneteit. A találmány szerinti vakcina előállítására a Bordetella bronchiseptica ATCC 31437 letéti számú törzsének tartósítás céljából fagyasztva szárított sejtjeit alkalmas táptalajra visszük és ezután a mikroorganizmus tenyésztését elősegítő kedvező hőmérsékleten inkubáljuk. Általában a Bordetella bronchiseptica mikroorganizmus tenyésztésére közölt eljárásokat alkalmazzuk [Am. J. Vet. Rés., 30, 1161—1162 (1969); Am. J. Vet. Rés., 33, 975, 1976 (1972)]. A mikroorganizmus tenyésztésére különösen a triptóz-foszfát folyékony táptalajt célszerű használni. Az ilyen triptóz-foszfát táptalaj alkalmas beszerzési forrása a Difco Laboratories, Inc., Detroit, Mich. Egyéb használható táptalajok a következők: Bordet—Gengou agar (Difco), agyvelő-szívfőzet folyékony táptalaj (Difco); triptóz-szójabab folyékony táptalaj (Osoid Limited, London, Anglia). Kedvező tenyésztési hőmérséklet a 36—38° C. A tenyésztett sejteket előnyösen koncentrálás nélkül centrifugálással vagy szűréssel nyerjük ki (gyűjtjük be). Mivel a sejteket élőkként kell használni, kívánatos, hogy a mechanikai feldolgozás folyamán elkerüljük a sejtek károsodását. Az 55. törzs sejtjeit kellően nagy koncentrációban tartalmazó sejttenyészeteket kaphatunk így, és a bennmaradt fermentációs tápanyagok a vakcina beadására a sejtekkel együtt maradhatnak. Általában a fermentálás utáni sejttenyészet legalább 1 • 107 élő sejtet tartalmaz ml-enként, és a koncentráció határértéke 1 ■ 107— 1 • 109 sejt/ml lehet. A vakcinaként való felhasználásra az 55. törzs sejtjeit előnyösen vizes szuszpenzió alakjában alkalmazzuk; azt az állatnak az orrjáratok nyálkahártyáira juttatva könnyen beadhatjuk. A sejtek vizes szuszpenzióját például injekciós fecskendővel mért mennyiségben vihetjük be az orrjáratokba vagy a vizes sejtszuszpenziót mért mennyiségben lehet az orrlyukakba fecskendezni. Ezért a sejtszuszpenziónak megfelelően folyékonynak kell lennie, hogy könnyen beadható vagy fecskendezhető legyen. A vakcinával kezelendő állattól és az intranazálisan beadandó sejtszuszpenzió mennyiségétől függően az élő sejtek koncentrációja tág határok között változhat, például 103—108 sejt/ml koncentrációk használhatók. De még kis állatok, például tcngerimalacok és házinyulak esetében is rendszerint orrlyukanként legalább ezer élő sejtet kell bejuttatnunk, a teljes adag tehát 2 • 103 sejt. Sertések és kutyák számára nagyobb adag, legalább 1 • 105 élő sejt/ml szükséges. A legkedvezőbb adagmennyiség rendszerint 1 • 106—1 • 108 sejt/ml lehet. Bár az állat orrüregébe vagy a légutakba máshol bejuttatott vakcinával megfelelő immunizációt lehet elérni, sertéseknél előnyös eljárás az, ha mindkét orrlyukba nagyjából egyenlő mennyiségű vizes sejtszuszpenziót juttatunk. Az adag térfogatát az orrlyukak által megtartani képes folyadékmennyiség korlátozza. A találmány szerinti eljárásban a sejtszámlálást szokásos módon lehet végezni. A vakcina milliliterenkénti sejtkoncentrációját úgy határozzuk meg, hogy a sejteket lemezen szélesztjük, és megszámoljuk a telepeket kialakító egységeket. A telepet kialakító egységek meghatározásához szükséges tenyésztést szokásos agar lemezeken, például 5%-os lóvér agaron, a triptóz-foszfát agaron vagy MacConkey-féle agaron végezhetjük. A légzőszerven keresztül való vakcináláshoz előállított, tárolható, szállítható vakcina adagegységek kialakítására a fermentálással kapott sejtszuszpenziót fagyasztva szárítjuk (liofilizáljuk). A fagyasztva szárítás előtt ismert módon mikrobiológiai mélyhűtés ellen védő stabilizálószert adunk. A mélyhűtés ellen védő stabilizálószert vizes oldatként adjuk hozzá, így a sejtek koncentrációja csökken. Ha például a fermentált anyag sejtsűrűsége 2 • 108 sejt/ml, akkor ez 1,3 • 103 sejt/ml-re csökkenhet. Ezenkívül, dacára annak, hogy mélyhűtés elleni védőszert adtunk hozzá, a sejtek fagyasztva szárítása csökkenti az élő sejtek koncentrációját. Az ilyen élősejt-pusztulás a fagyasztva szárítással együtt jár. Az 55. törzs sejtjeinek koncentrációja például mélyhűtés ellen védő stabilizálószer hozzáadása után 1,3- 108-ról a szárítás alatt 2 ■ 106-ra csökkent. Ezenkívül a fagyasztva szárított sejtek felhasználás előtti tárolása folyamán további életképességcsökkenés következhet be. A találmány szerinti eljárás értelmében a fagyasztva szárítás után a sejtek mért mennyiségét tárolás és szállítás céljára vakcina-fiolákba töltjük. A fiola legalább egy vakcinaadagot tartalmazzon, és egyszeri vagy többszörös adag alakjában lehet. Általában minden egyes vakcina adag legalább 1 • 106 élő sejtet tartalmazzon, például 1 • 106—1 ■ 108 határok között legyen az élő sejt tartalom. A vakcina beadása előtt a sejtekhez annyi steril vizet adunk, ami lényegesen kevesebb, mint a fagyasztva szárítás folyamán eltávolított víz térfogata. A sejtekhez hozzáadott víz mennyisége előnyösen legalább 25%-kal 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
