179956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének enzimjelzéses immunológiai meghatározására
11 179956 12 juk. Meghatároztuk, hogy a marha-szérumalbuminha mennyi trijódtironin épült be, és azt találtuk, hogy ez az érték 4,3 mól T3/l mól marha-szérumalbumin. b) „Első antitest” készítése (T3-antitestek) 5 Tween 80-at (50%), T3-marha-szérumalbumint (2 mg/ml) és Bacillus Çalmette-Guerint (BÇG 1 mg/ml) tartalmazó sóoldatból 1 részt keverünk 2 rész Marcol 52 adjuvánssal, és így stabil emulziót képezünk, Az emui- 10 zióból hat 1 ml-es dózist injektálunk szubkután az állatok hátába, és négy 0,75 ml-es dózist. intramuszkuM- risan a lábszárukba. Ellenőrizzük az antitest-titert, és 36 hét után az állatoknak emlékeztető oltást adunk. Ebből a célból hat 0,5 ml-es intramuszkuláris dózist 15 adunk az állatok lábszárába. Az emulzió 2 rész adjuvánsból és 1 rész, T3-marhaszértimalbumin-konjugátumot (2 mg/ml) tartalmazó sóoldatból áll. Az emlékeztető oltás után 10 nappal és a következő 2 hónap alatt vett vér magas T3 antitest-titerű. 20 c) Immunadszorbens készítése az első antitest tisztításához Sepharose 4B-t l,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnal 25 a már ismertetett módon aktiválunk, 4 ml aktivált Sepharose 4B-t 50 mg trijódtironint (T3) tartalmazó foszfát-pufferhez (pH=12,0, 0,025 mólos, 20. ml) keverünk, és a puffert szobahőmérsékleten 45 órán át keverjük. A gélt ezután foszfát-pufferrel (pH=12,0, 0,025 30 mólos, 250 ml), nátriumklorid-oldattal (0,1 mólos, 150 ml) és desztillált vízzel (1000 ml) mossuk. 1 ml duzzasztott gélbe 9 mg trijódtironint építünk be, A megmaradó bis?epoxidot úgy blokkoljuk, hogy a gélt térfogatára számítva, négyszeres. mennyiségű vizes .etanolaminban 35 (1 mólos, pH=ll) szuszpendáljuk, és 4 órán át rázzuk. A gélt ezután a feleslegben levő. etanolamin eltávolítása céljából desztillált vízzel alaposan kimossuk, d) Az „első antitest” tisztítása 40 20 ml anti-T3 szérumot (előállítását 1. fent) és 1 ml Ts-szubsztituált Sepharose-t (immunadszorbens, előállítását lásd fent) 1 órán át szobahőmérsékleten keverünk. A nem specifikusan adszorbeált proteineket foszfát-puf- 45 feros sópldattal (0,05 mólos, pH=7,0, 0,2 mólos nátrium-klorid) végzett alapos mosással távolítjuk el az immunadszorbensről, A.gélt a már említett módon kis oszlopba (fecskendőbe) töltjük, és sósavval (pH—3) mosva a foszfát-puffért eltávolítjuk^ A .T3-antitesteket 50 ■guaoidinrhidrokloridda! (4 ml, 6 mólos, pH=2) mosva eluáljuk, és veronál-pufferbe (1 ml, 0,05 mólos, pH—8,6, 0,1% marha-szérumalbumin) gyűjtjük, AT3-antitesteket a guanidin-hidroklorid eltávolítása céljából, a fenti pufferrel szemben alaposan dializáljuk, 55 3. Hordozóra vitt antigén (T3) előállítása a meghatározáshoz Az eljárás azonos a 2. c) szerintivel, ahol az első antitest tisztítására szolgáló, immunadszorbenst állítottuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a T3-konceotráció kisebb. Ez csökkenti a gélbe jutó szubszfituált T3 koncentrációját is. 60 65 A T3 meghatározását a fent ismertetett reagenseket használva, a már említett módon végezzük. Különböző eltérő eljárásváltozatok használhatók. Ezek a következők lehetnek; (1) eljárásváltozat Az „első antitest” komplexét az enzimmel jelzett „második antitesttel” ink,ubáljuk, így egy előzetesen kialakított komplexet kapunk, ezt az előzetesen kialakított komplexet adjuk a mintához. Megfelelő idő után ehhez adjuk az immunoadszorbenst (inszolubilizált antigén). (2) eljárásváltozat Ez a módszer a minta és az immunoadszorbens egyidejű hozzáadását foglalja magában. A következő példákban ismertetjük a fenti módszerekkel végzett meghatározások eredményét. Trijódtironin (T3) enzimjelzéses immunológiai meghatározása A Tj meghatározását több különböző eljárás alkalmazásával végeztük. 1. példa (1) eljárásváltozat Tisztított T3 antitesteket (1: 5000 hígítás) veronál-pufferben (0,05 mólos, pH=8,6, 0,1 súly/térfogatszázalék marha-szérumalbumin, 8,5 ml) enzimmel jelzett „második antitest”-tel (szamárból származó anti-birka IgG-^-galaktozidáz konjugátum, 5,1 ml) keverünk, és a keveréket szükség szerinti ideig 4°-op tartjuk-. T3 standardokat veronál-pufferben (50 p.1) összekeverjük az enzimmel jelzett „második, antitest”—„első antitest” komplexszel (200 pá), még 0,5 jjlI veronál-puffert adunk a keverékhez, és 4 órán át 4°-on tartjuk. A csövekben levő keverékhez T3 immunadszorbenst (50 fíg) adunk 0,4% Tween 80-at taí^almezp veronál-pufferben, éç a csöveket 1 órán át ,4“-on inkubáljuk- Az immunadszorbenst 5%, majd 1% nátriumkloridpt tartalmazó verpnál-pufferrel mossuk. Az immunadszorbenshez kötött enzimaktiyitásti,a, szokott módszerekkel mérjük. Eredmények : T3-konceptráció A Optikai sűrűség. A zéró kötés* (nmól/liter) (1 óra) százalékban 0 0,44: 100. 0,125 0,40 83 0,25 0,36 69 0,5 0,37 74 1 0,29 46 2 0,24 27 4 0,20 15 8 0,19 12 Nem-specifikus kötés 0,16. * A nem-specifikus kötés levonása után.számítva.. Ezt a kísérletet szamárból származó. anti:birka, Fçenzim jelzőanyaggal megismételtük. Az eredmények a fentiekhez hasonlóak voltak. 6
