179956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének enzimjelzéses immunológiai meghatározására
13 179956 14 (2) eljárásváltozat T3 standardokat veronál-pufferben (100 ul) össze- 5 keverünk enzimmel jelzett „második antitest”—„első antitest” komplexszel (200 p.1) és T3 immunadszorbenssel (25 (xg) 0,4 súly/térfogatszázalék Tween 80-at tartalmazó 100 p.1 veronál-pufferben, és a keveréket 2 órán át 4°-on inkubáljuk. Az immunadszorbenst mossuk, és a kötött 10 enzimet a szokott módon meghatározzuk. Eredmények : T3 koncentráció A Optikai sűrűség A zéró kötés* 2. példa (nmól/liter) (1 óra) százalékban 0 0,33 100 0,5 0,32 94 1 0,29 83 2 0,28 77 4 0,24 60 8 0,21 42 16 0,18 32 Nem-specifikus kötés 0,114. * A nem-specifikus kötés levonása után számítva. 3. példa (1) eljárásváltozat Az 1. példában leírtak szerint járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a standardokat hőkezelt plazmában készítjük el. A tiroidokat megkötő globulinokat elbontjuk úgy, hogy a plazmamintákat 70°-os vízfürdőn 1 órán át melegítjük. A kapott eredmények hasonlóak az 1. példa szerintiekhez. A találmány keretébe tartozik a találmány szerinti eljárásnak a specifikus antigénekkel történő végrehajtásához szükséges anyagokat tartalmazó készlet is. Egy 40 ilyen készlet tartalmazza a (1) tisztított első antitest és az enzimmel jelzett második antitest előzetesen kialakított komplexét és (2) egy inszolubilizált antigént, és kalibrálási célra előnyösen tartalmazza annak az antigénnek az ismert mennyiségét tartalmazó oldatát, amelyet a 45 készlettel ki akarunk mutatni, vagy meg akarunk határozni. Előnyös lehet, ha a szilárd fázist egy pálcikához erősítjük, amely a meghatározásra szolgáló keverék többi 50 komponenseibe helyezhető, vagy azokból eltávolítható. Ez megkönnyíti a szilárd fázis mosását és növeli a meghatározás pontosságát. így például egy trijódtironin (T3) meghatározására szolgáló készlet a következő komponensekből áll: 1. Oldhatatlan hordozó pufferben (például Veronái) szuszpendálva, vagy liofilizált formában, ehhez van kötve a T3 antigén. 2. Az első antitest (anti-T3, birkában termelve) és a második antitest (szamárban termelt anti-birka IgG Fc) előzetesen kialakított komplexe. A második antitest ß-galaktozidäzzal van jelölve, ez a komponens előnyösen liofilizált formában van. 3. Egy szubsztrátum (például nitrofenil-galaktozidáz) kb. 10—3 mól végső koncentrációban egy pufferben (például Veronái), amelynek pH-értéke előnyösen 7—9 és molaritása 0,010—0,200. Ez a komponens előnyösen liofilizált formában van. 4. A T3 antigén ismert mennyiségét (például 10 nmól/liter) tartalmazó oldat, ez a komponens előnyösen liofilizált formában van. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás valamilyen mintában egy antigén jelenlétének vagy mennyiségének enzimjelzéses immunológiai meghatározására azzal jellemezve, hogy folyékony közegben a) az antigént tartalmazó mintát, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni; b) oldhatatlan hordozóra való felvitellel vagy oldhatatlan 20 aggregátum formájában inszolubilizált immunogén vagy haptén antigént; c) az inszolubilizált antigénhez és az antigénhez képest, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni, ellentétes, és az inszolubilizált antigénre nem-specifikus antitestektől 25 tisztítással mentesített „első antitest”-et, és d) enzimmel jelzett olyan „második antitest”-et, amely (1) az „első antitest” immunoglobulin osztályával ellentétes, (2) az enzim és a „második antitest” közötti kovalens kötéssel enzimjelzett, és (3) az „első antitest” immunoglobulin 30 osztályába tartozó antitestekre nem-specifikus antitestektől tisztítással mentesített, érintkeztetjük, mégpedig úgy, hogy az inszolubilizált antigént és a mintát az „első anti- 35 test” és az enzimmel jelzett „második antitest” előzetesen kialakított komplexével reagáltatjuk olyan módon, hogy a „második antitest” a képződő oldhatatlan anyaghoz a mintában levő antigén mennyiségével fordított arányban kapcsolódjon, és a reakcióban oldható anyag is képződik; az oldhatatlan és oldható anyagot szétválasztjuk; az elválasztott oldhatatlan vagy oldható anyag enzimaktivitásának meghatározásával a mintában levő antigén jelenlétét kimutatjuk vagy mennyiségét meghatározzuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a komplexet a mintával, majd az inszolubilizált antigénnel reagáltatjuk, és a komplex mennyisége több, mint amennyi a mintában levő összes antigénnel reagálni képes, de éppen elegendő ahhoz, hogy a mintában levő összes antigén és az összes inszolubilizált antigén együttes mennyiségével 55 reagáljon. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a komplexet az inszolubilizált antigénnel és a mintával egyidejűleg reagáltatjuk. 60 4. Az 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a mintában levő antigénnel azonos inszolubilizált antigént használunk. 65 5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás 7
