179956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének enzimjelzéses immunológiai meghatározására
5 179956 6 enzimhez a tormaperoxidázon kívül, mivel ezek több mint egy molekula glutáraldehiddel reagálnak [Avrameas S. and Ternynck: Immunochemistry, 8, 1175 (1971)]. c) Az enzim szacharid-csoportjának oxidációja, majd Schiff-bázis képzése. A tormaperoxidáz több olígoszacharid-csoporttal rendelkezik, ezek oxidálása aldehidcsoportokká (perjodát alkalmazásával), amelyek aminocsoportokkal reagálni tudnak, képezi ennek a kapcsolási eljárásnak az alapját. Más enzimek szintén tartalmaznak oligoszacharid-csoportokat, és elvileg ugyancsak használhatók. Ezzel az eljárással azonban nagy molekulasúlyú konjugátumok képződnek [Nakane, P. K. and Kawaoki, A.: J. Histochem. Cytochem. 22, 1084(1974)]. d) Dimaleimides kapcsolás, N,N'-o-fenilén-dimaleimid alkalmazásával, miután az antitestbe —SH csoportokat vittek be úgy, hogy a már jelenlevő —S—S— hidakat 2-merkapto-etilaminnal két-két —SH csoporttá redukálták [Kató és tsai: European J. Biochem. 62,285(1976)]. e) Más bifunkciós reagensek, amelyek alkalmazhatók: a toluol-2,4-diizocianát, p',p-difluor-m,m'-dinitro-fenílszulfon, l-ciklohexil-3-(2-morfolino-etil)-karbodiimid, de ezek a fentiekhez viszonyítva általában gyengébb eredményeket adnak. /) Kapcsolást létesíthetünk még hetero-bifunkciós reagensekkel, vagyis olyan reagensekkel, amelyek minden molekulában két különböző funkciós csoportot tartalmaznak, ilyenek például az m-maleimido-benzii-N-hidroxi-szukcinimidészter, amit kétlépéses reakcióban alkalmaztak inzulinnak Q-galaktozidázhoz történő kapcsolásához [T. Kitagawa and T. Aikawa: J. Biochem. 79, 233 —236(1976)]. A viszonylag nagymennyiségű antitest kezelésével járó gyorsabb és kényelmesebb munka miatt gyakran célszerű, ha az „első antitest” és a „második antitest” inkább viszonylag nagy állatokban, így lóban, szamárban vagy birkában termelődik, mint kis állatokban, így patkányban, egérben, tengeri malacban vagy hörcsögben, bár ezek használata sincs kizárva. Mint már említettük, az „első antitest”-nek és a „második antitest”-nek különböző állatfajtákban kell termelődni. Azt találtuk, hogy célszerű, ha az „első antitest” birkában, míg a „második antitest” szamárban termelődik, de ha előnyös, bármely más, különböző fajta állatpár használható. Annak lehetősége, hogy a „második antitest” zavarja az antigén és az „első antitest” reakcióját, csökken, ha a „második antitest”-et nem az egész „első antitest”, hanem csupán az „első antitest”-et alkotó immunglobulin Fc fragmentuma ellen termeljük ki. A „második antitest”-et lényegileg ismert módon állíthatjuk elő, előnyös módon úgy, hogy az állatokat beinjekciózzuk, ezután termelődnek az antitestek, majd amikor a szérum antitest-szintek meghaladták a csúcsértéküket, az állatoknak emlékeztető dózist adunk. A vér a maximális antitest-szintet rendszerint rövid idővel az emlékeztető oltás után tartalmazza. Ha az állat véráramában megfelelően magas (vagy maximális) anti-immunglobulin szint alakult ki, akkor az állatot elvéreztetjük, és az anti-immunglobulint tartalmazó szérumot elkülönítjük. A „második antitest”-et előnyösen úgy tisztítjuk, hogy a szamár-antiszérumot megfelelő immunadszorbenssel, például sepharose-zal, vagy más oldhatatlan aktivált hordozóval inkubáljuk. Az immunadszorbenst úgy aktiváljuk, hogy először egy megfelelő bifunkciós reagenssel, például l,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnaI, majd a „második antitest” termeléséhez használt immunglobulin (vagy Fc fragmentuma) oldatával reagáltatjuk. így olyan immunadszorbenst kapunk, amely a „második antitest”-re specifikus, és az utóbbit úgy tisztíthatjuk, hogy az immunadszorbensen adszorbeáljuk, majd eluáljuk, amit az enzimmel történő jelzés előtt vagy után végezhetünk. Az enzimmel jelzett „második antitest” előállítása céljából előnyösen úgy járunk el, hogy a „második antitest”-et adszorbeálva tartalmazó immunadszorbenst egy reagenssel, így metilmerkapto-butirimidát-hidrokloriddal kezelve az antitest aminocsoportjait módosítjuk, és minden egyes antitest-molekulába 3—5 tiolcsoportot vezetünk be. A beépült merkaptocsoportokat tartalmazó „második antitest”-et ezután az immunadszorbensről eluáljuk, és megfelelő kezeléssel hozzákapcsoljuk az enzimet. Az antitestet ebből a célból előnyösen N,N'-o-fenilén-biszmaleimiddel kezeljük, majd általában E. coli-ból származó tisztított fí-galaktozidázzal reagáltatjuk. Az enzim- „második antitest” konjugátumot végül dietilaminoetil-agaróz gélen, vagy más megfelelő adszorbensen kromatografálva tisztítjuk úgy, hogy a konjugátumot a nem reagált enzimtől és a nem reagált „második antitest”-től elkülönítjük. Az „első antitest”-et egy megfelelő állatban, ismert módszerek alkalmazásával termeljük ki. Abban az esetben — és ez gyakran előfordul —, ha a kimutatandó vagy meghatározandó antigén viszonylag egyszerű kémiai szerkezetű haptén, például trijódtironin, ösztradiol, gentamicin, fenitoin vagy morfin, ez önmagában nem képes arra, hogy az „első antitest” termelődését előidézze. Ezért szükséges, hogy az antigént egy hordozómolekulához kapcsoljuk, s így olyan összekapcsolt molekulát állítsunk elő, amely képes arra, hogy az antitest termelődését előidézze. Ebből a célból az antigént megfelelő módon egy olyan könnyen beszerezhető proteinhez kapcsoljuk, amely idegen attól az állattól, amelyben az „első antitest” termelődik, például marha-szérumalbuminhoz. A kapcsolást úgy végezhetjük, hogy az albumint vagy más proteint például l-etil-3-(3-dímetilaminopropil)-karbodiimiddel reagáltatjuk, majd az így kapott terméket reagáltatjuk az antigénnel, amelynek ehhez a reakcióhoz egy aminö- vagy karbonsav-csoportot kell tartalmaznia. Kívánt esetben más ismert kapcsolási módszerek is használhatók. Ideális esetben kb. 3—30 molekula antigént kell beépíteni az albumin vagy más nagy molekulasúlyú protein minden egyes molekulájába. Az „első antitest”-et úgy termelhetjük ki, hogy az antigént vagy az antigén-konjugátumot heteken vagy hónapokon át ismételten egy megfelelő állatba, például birkába injektáljuk, amíg az állat véráramában a szükséges kötési tulajdonságokkal rendelkező, megfelelő magas antitest-titer létrejött. Ekkor az állatot elvéreztetjük, és az anti-szérumot elkülönítjük. Az „első antitest”-et ezután előnyösen úgy tisztítjuk, hogy oldhatatlan hordozón reagáltatjuk azzal az antigénnel, amely ellen az antitestet kitermeltük, vagy valamely rokonvegyülettel. Adszorpció után az antitesteket eluálhatjuk, például guanidin-hidroklorid oldattal magas vagy alacsony pH-értéken, nagykoncentrációjú só5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
