179956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének enzimjelzéses immunológiai meghatározására
7 179956 8 oldatokkal, vagy nemvizes oldószerekkel, majd az eluáló reagens eltávolítása céljából megfelelő pufferrel szemben dializáljuk. Az említett tisztítási eljárásban és a találmány szerinti eljárásban az antigént, vagy ezzel rokon vegyületet hordozó oldhatatlan anyag lehet bármely megfelelő, vízben oldhatatlan anyag, amelyhez az antigén vagy ezzel rokon vegyület elég erősen köthető ahhoz, hogy a tisztítás vagy a meghatározás reakciói alatt a kötés megmaradjon. Használhatunk ugyan olyan hordozót, amely egyszerűen adszorbeálja az antigént, mint ahogyan azt Engvall és tsai ismertetik az említett irodalmi helyen, előnyösebb azonban, ha az antigént kémiailag kötjük a hordozóhoz. Ez azt jelenti, hogy a hordozónak funkciós csoportokat kell tartalmaznia, amelyeken keresztül a szükséges reakciók végbemehetnek. Üveg, nylon, poliakrilamid, cellulóz vagy dextrán hordozók használhatók. Az immunadszorbensek bizonyos típusait, amelyek hidroxilcsoportokat tartalmaznak, reagáltathatjuk 1,4- -bisz(2,3-epoxipropoxi)-butánnal, és az így kapott terméket reagáltatjuk az antigénnel. Ez a módszer egyszerűnek, biztosnak, hatékonynak mutatkozott, és stabil kovalens kötést biztosít, feltéve, hogy az antigén, vagy ezzel rokon vegyület hidroxil-, amino- vagy tiolcsoportokat tartalmaz. Az antitestek tisztítására szolgáló immunadszorbens iránti követelmények nem szükségszerűen azonosak a meghatározás során használt immunadszorbens iránt támasztott követelményekkel. A találmány szerinti eljárás több különböző változatban elvégezhető. Az „első antitest” és így az oldhatatlan antigénhez kötött jelzőanyag mennyisége fordított arányban van a vizsgálandó mintában levő antigén mennyiségével. A szabad enzimaktivitást, vagy az oldhatatlan, illetve hordozóra vitt antigénhez kötött enzimaktivitást kimutatjuk vagy mérjük. A találmány szerinti eljárás néhány specifikus kiviteli módját a következőkben ismertetjük. Egyik változat szerint az „első antitest”-et az enzimmel jelzett „második antitest”-tel reagáltatva komplexet képezünk, amit azután feleslegben adunk a meghatározandó antigént tartalmazó mintához, és a keveréket inkubáljuk. Ezután a keverékhez adjuk az oldhatatlan hordozóra vitt antigént, inkubáljuk, és a szilárd és folyékony fázist elkülönítjük. A folyékony fázis enzimaktivitásának meghatározásából kapott eredmény egyenesen arányos a mintában levő antigén mennyiségével. Egy másik változat szerint az „első antitest”-ből és a „második antitest”-ből képezett komplexet, a meghatározandó antigént tartalmazó mintát és az antigént tartalmazó hordozót egyidejűleg inkubáljuk, a szilárd fázist elkülönítjük, és a folyékony fázis enzimaktivitását meghatározzuk. Az eredmény szintén egyenesen arányos a mintában levő antigén koncentrációjával. Amint azt már említettük, a fenti első eljárással végzett kvantitatív meghatározás esetében az alkalmazott „első antitest” mennyiségének feleslegben kell lennie ahhoz a mennyiséghez viszonyítva, amelynek a mintában levő összes antigénnel reagálni kell, és az antigént tartalmazó hordozót megfelelő feleslegben kell alkalmazni ahhoz, hogy a mintában levő antigénnel nem reagált ôsszçs „első antitest” adszorpcióját lehetővé tegyük. Gyakorlatilag ennek a legegyszerűbb módja, ha egy sorozatmegji^tározást végzünk az „első antitest” geometriai vagy számtani sorban vett különböző koncentrációival. Ha ezt elvégeztük, akkor egyszerű megállapítani az „első antitest” azon koncentrációját, amely pontos meghatározás elvégzését teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját a példák szemléltetik. A példákban megadott hőmérsékleti értékek °C-ban értendők. Reagensek előállítása 1. „Második antitest” előállítása és jelzése a) Birka immunglobulin (IgG) Fc fragmentumának előállítása Birka immunglobulin Fc fragmentumának előállítását Porter módszerével [R. R. Porter: Biochem. J. 73, 119 (1959)] végezzük. 320 ml szérumot gyűjtöttünk 28 birkából. 150 ml szérumot 30 g nedves dietilaminoetil-(DEAE> — A 50 Sephadex géllel — amit előzetesen 10 mmólos foszfát-puíTerrel 6,5 pH-értéken kiegyensúlyoztunk — keverés közben jégfürdőben inkubálunk. 1 óra elteltével a gélt durvaszemcsés zsugorított üvegszűrőn szűrjük, és 50 ml 10 mmólos, 6,5 pH-értékű foszfát-pufferrel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékokat még egyszer inkubáljuk 30 g nedves DEAE-Sephadex géllel, szűrjük, és 100 ml fenti foszfát-pufferrel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékokat (300 ml) 150 ml telített ammónium-szulfát-oldattal kezeljük, amit lassan, folytonos keverés közben adunk az oldathoz. A csapadékot kiszűrjük, és 100 ml 20%-os ammónium-szulfát-oldattal mossuk. Az így kapott csapadékot 50 ml, 8,0 pH-értékű 50 mmólos foszfát-pufferban feloldjuk, és 4°-on 5 liter desztillált vízzel szemben éjszakán át dializáljuk, majd az oldatot liofilizáljuk. 1,50 g így kapott liofilizált birka IgG-t feloldunk 10 mmól ciszteint és 2 mmól etiléndiamintetraecetsavat tartalmazó 50 ml, 0,1 mólos, 7,2 pH-értékű trisz-HCl pufferban. A puffert közvetlenül a felhasználás előtt készítjük el. Az oldathoz papaínnak (SIGMA, kétszer kristályosított) 50 mmólos, 4,5 pH-értékű acetát-puíferrel készített 0,6 ml kristályos 'szuszpenzióját adjuk. Az oldatot 37°-on 4 órán át inkubáljuk, miközben néha megrázzuk. Az oldathoz ezután 0,222 g jódacetamidot adunk, és az oldatot azonnal G—100 Sephadex-oszlopra (80x5 cm) visszük, amelyet előzetesen 10 mmólos, 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel 4°-on kiegyensúlyoztunk. Az oszlopról 10 mmólos, 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel eluált második csúcs az Fc és Fab fragmentumok keverékét tartalmazza. Az első csúcs emésztetlen IgG-t tartalmaz. A második csúcsot karboximetilcellulóz oszlopra (Whatman CM 32, 50 x 2,5 cm) visszük, amit előzetesen 10 mmólos, 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel 4' -on kiegyensúlyoztunk. Egy csúcsot eluálunk az oszlopról 10 mmólos 5,6 pH-értékű acetát-pufferrel mosva, és több kisebb csúcsot és egy nagyobb csúcsot eluálunk, ha 10 mmólos — 500 mmólos acetát-pufferrel 5,6 pH- értéken gradiens-elúciót végzünk (1000 ml a grádienskeverő mindegyik tartályában). A nagyobb csúcsot összegyűjtjük, és a karboximetilcellulóz oszlopon újra kromatografáljuk. Ezúttal 10 mmólos — 300 mmólos gradiensű, 5,6 pH-értékű acetát-puffert alkalmazunk, a keverőedényben 1000 ml-rel. Egyetlen csúcsot eluálunk, ezt összegyűjtve desztillált vízzel szemben alaposan dializaljuk és liofilizáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
