179956. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antigének enzimjelzéses immunológiai meghatározására
3 179956 4 tumot reagáltatták egy enzimjelzéses anti-immunglobulinnal, amely a konjugátum antitest-részével reagálni tudott. Ebben az eljárásban a hordozóhoz kötött enzim mennyisége a mintában levő antitest mennyiségétől függ, mivel az enzimnek a hordozóhoz való kötésére a meghatározandó antitest pontosan értékelhető és lényeges befolyást gyakorol. A találmány szerinti meghatározási módszer az ismertektől eltérő jellegű és az antigén meghatározására ezt az antigént és inszolubilizált ismert antigént is enzimmel jelzett anyaggal reagáltatjuk. A találmány tehát módszer valamilyen mintában egy antigén jelenlétének vagy mennyiségének enzimjelzéses immunológiai meghatározására olyan módon, hogy folyékony közegben (a) az antigént tartalmazó mintát, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni ; (b) oldhatatlan hordozóra való felvitellel vagy oldhatatlan aggregátum formájában inszolubilizált immunogén vagy haptén antigént; (c) az inszolubilizált antigénhez és az antigénhez képest, amelynek jelenlétét vagy mennyiségét kívánjuk meghatározni, ellentétes (azaz anti), és az inszolubilizált antigénre nem-specifikus antitestektől tisztítással mentesített „első antitestet”, és (d) enzimmel jelzett olyan „második antitestet”, amely (1) az „első antitest” immunoglobulin osztályával ellentétes, (2) az enzim és e „második antitest” közötti kovalens kötéssel enzimjelzett, és (3) az „első antitest” immunoglobulin osztályába tartozó antitestekre nem-specifikus antitestektől tisztítással mentesített, érintkeztetjük; az inszolubilizált antigént és a mintát az „első antitest” és az enzimmel jelzett „második antitest” előzetesen kialakított komplexével reagáltatjuk olyan módon, hogy a „második antitest” a képződő oldhatatlan anyaghoz a mintában levő antigén mennyiségével fordított arányban kapcsolódjon, és a reakcióban oldható anyag is képződik; az oldhatatlan és az oldható anyagot szétválasztjuk; és a szétválasztott oldható vagy oldhatatlan anyag enzimaktivitásának meghatározásával a mintában levő antigén jelenlétét kimutatjuk vagy mennyiségét meghatározzuk. A találmány szerinti eljárásban az „első antitest” és a „második antitest” komplexét a kimutatandó vagy meghatározandó antigént tartalmazó mintával érintkeztetjük, amely az inszolubilizált antigénnel azonos vagy ettől eltérő lehet. Az „első antitest” kifejezés a leírásban és az igénypontokban olyan antitestet jelent, amely mind az oldhatatlan hordozón levő antigént, mind a kimutatandó antigént képes megkötni. A meghatározási módszer csak olyan antigén meghatározásánál használatos, amelyhez az „első antitest” is kapcsolódhat. A „második antitest” kifejezés olyan antitestet jelent, amely specifikus annak az immunoglobulin-osztálynak minden antitestére, amelyhez az első antitest tartozik, például valamennyi birka IgG-re, nyúl IgG-re vagy nyúl IgM-re. Például: ha az „első antitest” egy bizonyos állatban, például birkában termelődött immunglobulin, akkor a „második antitest” egy, az ennek az állatfajnak az immunglobulinjai ellen ható antitest. Ez a „második antitest” egy másik állapotban, például szamárban termelődik, és egyéb saját antitest sajátosságai érdektelenek. A találmány szerinti eljárás könnyen alkalmazható nagyszámú, különböző antigén kimutatására és meghatározására. A jellegzetes antigének, így az emberi koriongonadotropin, a szérum és a szövetproteinek, például aj-foetoprotein, a2-haptogIobulin és karcinoembrionális antigén mellett használhatók haptének, így hormonok, például trijódtironin, norepinefrin, pajzsmirigy stimuláló hormon, folluculus stimuláló hormon, luteinizáló hormon, inzulin és tiroxin; szteroidok, például kortizol, progeszteron, ösztron, ösztradiol és tesztoszteron ; gyógyszerek, például morfin, amfetamin, barbiturátok, difenilhidantoin, metotrexát és gentamicin; vitaminok és tápanyag-szennyezők, például piridoxál-5-foszfát és aflatoxin; herbicidek, inszekticidek és nitrozokarbamidok. Az antigént minden esetben megfelelő hordozóhoz kell kötni kémiai vagy — kevésbé előnyösen — fizikai úton, például a később részletesen ismertetendő módon. Meg kell jegyeznünk, hogy az enzimmel jelzett, „második antitest” jellege nem függ a kimutatandó antigéntől. Csupán az szükséges, hogy az „első antitest”-et ugyanolyan fajtájú állatban termeljük, mint amilyen fajtájú állat immunglobulinjával idéztük elő a „második antitest” képződését egy másik állatfajtában. Ezért nincs szükség arra, hogy nagyszámú különböző enzimjelzéses antitestről gondoskodjunk, az enzimeknek antitestekhez történő kapcsolásával járó nehézségeket csak egyszer kell leküzdeni. A „második antitest” jelzésére bármely enzim használható. Az oxidázok, így torma-peroxidáz, hidrolizáló enzimek, így alkalikus foszfatáz, vagy dehidrogenázok, így glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz különösen alkalmasak erre a célra. A jelzőanyagként használt enzim ideálisan a következő tulajdonságokkal rendelkezik: (1) viszonylag olcsón, nagy tisztaságban kapható, (2) aktivitása egy súlyegységre nagy; (3) vízben könnyen oldható és a szokásos tárolási körülmények között stabil; (4) egyszerű, gyors, érzékeny és olcsó meghatározási eljárás alkalmazását lehetővé teszi; (5) biológiai folyadékoktól mentes, és (6) a biológiai folyadékok ne tartalmazzanak szubsztrátum-inhibitorokat vagy aktivátorokat; (7) a második antitesthez történő kapcsolódáshoz megfelelő kémiai csoportokkal rendelkezzék, hogy olyan kapcsolódást tegyen lehetővé, amely csak minimális hatással van az enzim és az antitest aktivitására. Ezeknek a követelményeknek megfelel a (i-galaktozidáz. Más használható, de kevésbé előnyös enzimek a glükóz-oxidáz, acetilkolinészteráz, glükoamiláz, lizozim, glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz és malát-dehidrogenáz. Az alkalmazott enzimet előnyösen egy később ismertetendő kapcsolási eljárással kapcsoljuk a „második antitest”-hez, ez az eljárás az antitest és enzim bármely kombinációjához használható, feltéve, hogy az enzim merkaptocsoportot tartalmaz, vagy úgy módosítható, hogy ilyen csoportot tartalmazzon. Kívánt esetben azonban más kapcsolási eljárások is alkalmazhatók, ezek a következők: a) Egylépéses glutáraldehides kapcsolás, ahol glutáraldehidet használunk a proteinek kapcsolására komplikált reakcióban, így nagy molekulasúlyú heterogén konjugátumokat kapunk [Avrameas, S.: Immunochemistry 6,43 (1969)]; b) kétlépéses glutáraldehides kapcsolás, ahol a tormaperoxidáz enzim csupán egy molekula glutáraldehiddel reagál. Ez megakadályozza az enzim-enzim kötést, és az egylépéses módszerhez képest tökéletesítést jelent. Ez az eljárás azonban valószínűleg nem használható sok más 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
