179936. lajstromszámú szabadalom • Leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló diagnosztikai eszköz és eljárás ehhez megfelelő kromogének előállítására
3 179936 4 púinak. (Lásd például A. G. E. Pearse, Histochemistry, Theoretical and Applied.) Lényegében színtelen vagy enyhén színes észtereket alkalmaznak, amelyek az enzimes hasítás során legtöbbnyire színtelen sav- és ugyancsak színtelen alkohol-(fenol)-komponensre esnek szét. Utóbbiakat azután az enzimes elszappanosítási követő reakcióban színes termékekké reagáltatják (például diazóniumsókkal való kapcsolással vagy oxidativ reakciókkal). F. Schmalzl és H. Braunsteiner például a Kiin. Wschr. 46, 642 (1968)-ban leírtak egy specifikus citokémiai leukocita-észteráz kimutatást, ahol szubsztrátként Naphtol-AS-D-klór-acetátot és valamilyen diazóniumsót használtak a színes azovegyület képzéséhez. Leukociták testfolyadékokban, így például vizeletben való gyors és egyszerű kimutatására szolgáló diagnosztikai eszközként ilyenfajta kétkomponensű rendszerek nem bizonyultak megfelelőnek, mivel a vizeletben előforduló sok egyéb vegyidet, így urobilinogén, szterkobilinogén, bilirubin és egyebek szintén reagálnak diazóniumsókkal. Ebből eredően ez a kimutatási módszer túlságosan érzéketlen. Például 5000 leukocita/tzl esetében semmilyen reakciót nem mutatnak a minták. Meglepő módon azt találtuk, hogy stabil és gyorsan jelző diagnosztikai eszközt kapunk, amellyel leukociták testfolyadékokban jól kimutathatók, ha a neutrofil leukocita-granulocitákban előforduló észterázok kimutatására szubsztrátként azoszínezék-észtereket használunk. A jelen találmány tárgya leukociták testfolyadékokban való kimutatására szolgáló olyan diagnosztikai eszköz, amely egy színképzővel (kromogénnel) és szokásos adalékanyagokkal impregnált szívóképes hordozóból áll, és az jellemzi, hogy a leukocitákban előforduló észterázok kimutatására I általános képletű azoszínezékésztereket — a képletben A jelentése 1 vagy 2 nitrogénatomot, kénatomot, oxigénatomot tartalmazó, öttagú vagy hattagú heterociklusos gyűrű, amely adott esetben halogénatommal vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal egyszeresen szubsztituált és amely egy, adott esetben rövidszénláncú alkil- vagy alkoxicsoporttal szubsztituált aneflált benzolgyűrűt tartalmazhat, vagy rövidszénláncú alkilcsoporttal, rövidszénláncú alkoxicsoporttal, nitrocsoporttal, szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsav-gyökkel és/vagy benzoil-amino-csoporttal egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan szubsztituált fenilcsoport, B jelentése adott esetben szulfonsav-, illetve alkálifém-szulfonsav-gyökkel, rövidszénláncú alkoxicsoporttal és/vagy rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoporttal egyszeresen vagy kétszeresen szubsztituált benzol-, naftalin-, vagy kinolin-maradék, R jelentése benzoilcsoport vagy valamely 2—5 szénatomos alifás acilcsoport, vagy valamely, terc-butoxi-karbonil-, benziloxi-karbonil- vagy p-toluolszulfonil-védőcsoporttal védett, nem heterociklusos, élővilágban előforduló mono-amino-monokarbonsavgyök vagy valamely 2—6 tagszámú, nem heterociklusos élővilágban előforduló monoamino-monokarbonsavakból álló peptid-gyök, és n jelentése 1 vagy 2 —. A találmány további tárgya eljárás az I általános képletű azoszínezék-észtereket tartalmazó, leukociták testfolyadékokban való meghatározására szolgáló diagnosztikai eszközök előállítására. Az összes I általános képletű azoszínezék-észter új vegyület. A találmány tárgya továbbá eljárás az I általános képletű azoszínezék-észterek előállítására. Az I általános képletű új azoszínezék-észtereket a fenilészterek szintézisére ismert módszerek szerint állíthatjuk elő. Előnyösen, önmagában ismert módon, valamely II általános képletű megfelelő azoszínezéket — ahol A, B és n jelentése az előbb megadottakkal azonos —, egy III általános képletű savval — ahol R jelentése az előbb megadottakkal azonos —, illetve ennek megfelelő reakcióképes származékával reagáltatunk. A karbonsavészterek előállításánál reakcióképes származékokként főleg a megfelelő karbonsavanhidrideket, illetve karbonsavkloridokat használjuk, adott esetben tercier aminok hozzáadásával. Az aminosav- és peptid-észterek előállítására a peptidkémiában szokásos szintézismódszereket alkalmazzuk. A II általános képletű azoszínezékek ismert anyagok [lásd például H. R. Hovind, The Analyst, 100, 769 (1975)], vagy ismert vegyületek analógiájára állíthatók elő. Az A jelentésénél említett halogénatomon fluor-, klór- vagy brómatom, előnyösen brómatom értendő. Az A jelentésénél említett „rövidszénláncú alkilcsoport” valamint az A és B jelentésénél említett „rövidszénláncú alkoxicsoport” 1—4, előnyösen 1—3 szénatomot tartalmaz. Különösen előnyös a metil-, metoxi- és etoxi-csoport. A B jelentésénél említett „rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkilénoxi)-csoport” 2—4, előnyösen 2—3 alkilén-oxi-csoportot tartalmaz, előnyösen etilénoxicsoportokat. Különösen előnyös „rövidszénláncú alkoxi-2-4 tagszámú (rövidszénláncú alkílénoxi)-csoport” a 3,6-dioxa-heptiloxi-csoport. Az A és B jelentésénél megadott szulfonsavgyök vagy maga a szulfonsavgyök (—S03H) vagy ennek valamilyen alkálifém-sója. Különösen előnyös a nátriumsó. Az R szubsztituenseknél említett 2—5 szénatomos alifás acilcsoportok közül előnyösek a 2—3 szénatomosak. Különösen előnyös az acetilcsoport. Az R szubsztituens jelentésénél említett monoamino-monokarbonsav-gyökök természetes L-a-aminosavak savgyökei. Főként a glicin, L-alanin és L-fenilalanin savgyöke előnyös. Az R szubsztituens jelentésénél említett peptidgyökön di-, tri-, tetra- és pentapeptidek, előnyösen di- és tripeptídek gyökei értendők, ahol aminosav-komponensekként az előbb említett aminosavak szerepelnek. Az RO-oldalláncok bármely helyzetben kapcsolódhatnak a benzol-, naftalin-, illetve kinolin-gyűrűhöz. Az azocsoportok azonban az RO-szubsztituensekhez képest mindig orto- és/vagy para-helyzetben helyezkednek el. A találmány szerint kromogénként használt I általános képletű azoszínezék-észtereket 10 4—1CU1 mól/liter, előnyösen 10-3—10“2 mól/liter koncentrációban alkalmazzuk az impregnáló oldatban. A leukociták kimutatására szolgáló diagnosztikai eszköz további alkotórésze valamilyen megfelelő puíferrendszer. Például foszfát-, barbiturát-, borát-, trisz(hidroxi-metíl)-amíno-metán- (TRIS), 2-amino-2-metiI-1,3-propándiol- (Amediol) vagy aminosav-pufferek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
