179788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új karbapeném-származékok előállítására
41 179788 42 4. Toxicitás A PS—7 antibiotikum-nátrium-sóját intraperitoneálisan alkalmazzuk DDY hím egereken (Shizuoka). Akut toxicitás nem lép fel. 5. Ismert fl-laktamázokkal szembeni érzékenység (a PS—7 antibiotikumnak, mint enzim szubsztrátumnak a tulajdonságai) A PS—7 antibiotikum nátrium-sójának, mint szubsztrátumnak a viselkedését Bacillus cereus 569 inducible penicillinase-zal (ATCC 27348) szemben vizsgáljuk az alábbiak szerint: (A) Reagens (1) Szubsztrátum A PS—7 antibiotikum nátrium-sóját megfelelő koncentrációban feloldjuk 100 mM foszfát-puffer-oldatban (pH=6,8). (2) p-laktamáz Az ampicillin által termelt Bacillus cereus 569 inducible penicillinase-t (ATCC 27348) CM-cellulóz (Brown Co.) oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Az enzimkészítmény penicillin G-vel mért hatása 14 800 egység/ml. (B)fReakció és vizsgálati feltételek A szubsztrátumként szolgáló PS—7 antibiotikumoldatot 30 °C hőmérsékleten melegítjük. Az oldatból 3,0 ml-t optikai kvarc küvettába öntünk, majd az enzim adagolásával és az oldat keverésével beindítjuk a reakciót. A reakciót 30 °C hőmérsékleten hajtjuk végre és vizsgáljuk 308 nm-en a PS—7 antibiotikum szubsztrátum abszorpciójának csökkenését. 308 nm-nél az e értéke 9720. Ennek az értéknek a meghatározásánál abból a feltételből indulunk ki, hogy a PS—7 antibiotikumnak a fenti enzimmel történő teljes lebomlása esetén mért abszorpciócsökkenés 10 800. (C) Eredmény 3 ml, 10 pl penicillinase készítményt és 102 m pmól PS—7 antibiotikumot (végső koncentrációja 34 m pmól/ml) tartalmazó reakcióelegyet a fent megadott körülmények között inkubálunk, és mérjük a PS—7 antibiotikum koncentrációcsökkenésének változását az inkubációs idő függvényében. Az eredmények alapján Shyun-Long Yun és Clarence H. Suelter módszerével (Biochemica et Biophysica Acta 480, 1—13, 1977) meghatározott KM érték 13,0 pM. 10. példa PS—6 antibiotikum-tritil-észter 25,9 g, 9. példa szerint előállított fehér, fagyasztva szárított PS—6 antibiotikum-nátrium-sót feloldunk 5 ml dimetilformamidban és 20 p.1 trietilaminban, majd ezt követően hozzáadunk a reakcióelegyhez 50 mg tritilkloridot. Szobahőmérsékleten 3 órán át keverés után hozzáadunk a reakcióelegyhez 200 ml benzolt és 3 x 70 ml 0,1 M foszfát-puffer-oldattal (pH=6,8) mossuk. Az így kapott reakcióelegyet 3 ml telített vizes nátriumkloridoldattal dehidratáljuk, majd a benzolos oldatot vízmentes nátriumszulfáton szárítjuk. A benzolt csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és így mintegy 0,5 ml benzolos oldatot kapunk, melyet Bio-Beads S—X3 (Bio-Rad Laboratories) oszlopon (1,2x96,0 cm) engedünk át. A kromatogramot benzollal fejlesztjük ki. Az így kapott aktív frakciót összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot feloldjuk 0,5 ml acetonban, majd Sephadex LH—20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopra (1,2x96,0 cm) visszük, melyet előzőleg acetonnal kezeltünk, és acetonnal kifejlesztjük a kromatogramot. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, így 23,7 mg fehér port kapunk. Ezt az anyagot benzoln-hexán elegyéből átkristályosítjuk. így 17,5 mg színtelen fehér kristályt kapunk, mely a PS—6 antibiotikum tritil-észtere. Az anyagon a következő fizikai-kémiai vizsgálatokat végezzük el : 1. Szín Színtelen 2. Ultraibolya abszorpciós spektrum A PS—6 antibiotikum tritil-észterének ultraibolya abszorpciós spektrumát 100 pg/3 ml metanol koncentrációban Hitachi Double Beam Spectrophotometer Model 200—20 berendezésben (Hitachi, Ltd.) vizsgáljuk. X^?«=315 nm 3. Infravörös abszorpciós spektrum 200 pg PS—6 antibiotikum-tritil-észtert feloldunk 0,3 ml kloroformban és káliumbromid alkalmazásával Hitachi Infrared Spectrophotometer berendezésben (Model 260—30, Hitachi Ltd.) vizsgáljuk az infravörös abszorpciós spektrumot. Az infravörös abszorpciós spektrumot a 7. ábrán tüntetjük fel. A megadott hullámszámoknál a következő jellemző abszorpciós maximumot találjuk : (i) 1780 cm-1 (ß-laktäm gyűrű —CO— csoportja) (fi) 1700 cm-1 (amid kötés —CO— csoportja) (iii) 1700 cm“1 (azészter kötés—COOe—csoportja) 4. Oldhatóság A PS—6 antibiotikum-tritil-észter oldhatóságát úgy vizsgáljuk, hogy 5 mg PS—6 antibiotikum-tritil-észtert 20 °C hőmérsékleten feloldunk az alább felsorolt oldószerek 0,1 ml-ében. Az eredmények a következők: Teljesen oldhatatlan vízben és n-hexánban. Kissé oldódik benzolban, etilacetátban, kloroformban, metanolban, etanolban, acetonban, dimetilformamidban és dimetilszulfoxidban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
