179788. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új karbapeném-származékok előállítására
35 179788 36 lati lemezre 8 mm átmérőjű cellulóz lemezeket helyezünk, melyeknek mindegyik 20 [i.1, 240 [xg/ml koncentrációjú PS—6 antibiotikum-oldatot tartalmaz és 35 °C hőmérsékleten 18 órán keresztül inkubáljuk, majd leolvassuk a gátló zóna nagyságát. Ugyanilyen úton készítjük a kontroll céljára szolgáló vizsgálati lemezt, azzal az eltéréssel, hogy az agar nem tartalmaz penicillin G-t, illetve cefaloridint. A fenti feltételek mellett elvégezzük 20 ul, 10 000 (xg/ml koncentrációjú penicillin G, illetve cefaloridin lemezvizsgálatát is. Az eredményeket a 6. táblázat mutatja. A 6. táblázat adatai szerint a PS—6 antibiotikumnak nem kimutatható mennyiségben a penicillin G-hez vagy 5 a cefaloridinhez való adagolása egyértelműen szinergetikus hatást eredményez ß-laktäm-rezisztens mikroorganizmusokkal szemben. Ha a PS—6 antibiotikum helyett penicillin G-t cefaloridint adagolunk, szinergetikus hatás nem mutatkozik. 6. táblázat ß-laktäm-rezisztens mikroorganizmus Gátlózóna, mm lemez kontroll penicillin G-vel cefaloridïnnel Proteus vulgaris P—5 PS—6 14,0 30,0 28,5 penicillin G 15,0 15,0 15,0 cefaloridin 12,0 12,0 12,0 Citrobacter freundii PS—6 22,0 23,0 25,0 E—9 penicillin G 0,0 0,0 0,0 cefaloridin 12,0 12,0 12,0 Serratia marcescens PS—6 20,0 22,0 26,0 penicillin G 0,0 0,0 0,0 cefaloridin 11,0 11,0 11,0 3. In vivo hatás A PS—6 antibiotikum-nátrium-só terápiás hatását egereken vizsgáljuk, melyeket 5 x 103 sejt/egér mennyiségű Staphylococcus aureus Smith baktériummal fertőztünk meg intraperitoneálisan. A fertőzés után rövid idővel a PS—6 antibiotikum-nátrium-só vizes oldatát adagoljuk szubkután. DDY hím egerek (Shizuoka) esetén a készítmény 50%-os hatásos adagja 5,2 mg/kg. 4. Toxicitás DDY hím egereknek (Shizuoka) intraperitoneálisan PS—6 antibiotikum-nátrium-só készítményt adagolunk 40 vizes oldat formájában injekcióban 500 mg/kg mennyiségben. Akut toxicitás nem lép fel. 5. Ismert (3-laktamázokkal szembeni érzékenység (a PS—6 antibiotikumnak, mint enzim szubsztrátumnak a tulajdonságai) A PS—6 antibiotikum-nátrium-sójának, mint enzim szubsztrátumnak S-laktamázzal szembeni érzékenységét Bacillus licheniformis 749/C exo-penicillinase-zal (ATCC 25972) és Bacillus cereus 569 inducible penicillinase-zal (ATCC 27348) szemben vizsgáljuk az alábbi feltételek mellett: (A) Reagens (1) Szubsztrátum A PS—6 antibiotikum-nátrium-só készítményt megfelelő koncentrációban feloldjuk 25 nM foszfát-puflferban (pH=6,8). (2) 3-laktamáz (a) Bacillus licheniformis 749/C exo-penicillinase-t (ATCC 25972) Cephalexin-Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals AB) oszlopon oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Az enzimkészítmény hatása 16 600 egység/ml, melyet a penicillin G-kálium-só hidrolízise után 30 °C hőmérsékleten M/10, 6,8 pH-jú foszfát-pufferban jodometriával határozunk meg. Egy egység penicillinase azt 30 az enzimmenyiséget jelenti, mely 60 perc alatt 30 °C hőmérsékleten 6,8 pH érték mellett 1 mikromól penicillin G-t képes hidrolizálni. (b) Bacillus cereus 569 inducible penicillinase (ATCC 27348). Ezt a fj-laktamázt az ampicillin termeli, CM- 35 cellulóz oszlopkromatográfiával tisztítjuk. Hatása 26 900 penicillin G-kálium-só egység/ml. (B) Reakció és vizsgálati feltételek 1 cm-es kvarc küvettában levő 3 ml, pufferban készített PS—6 antibiotikum-nátrium-só-oldathoz 30 °C hőmérsékleten megfelelő mennyiségű [i-laktamázt adunk és a reakció megindítása céljából azonnal keverni kezdjük. A hidrolízis időbeni lefutását 30 °C hőmérsékleten 45 a 301 nm-nél mért optikai sűrűség csökkenésével követjük nyomon, mely megfelel a PS—6 antibiotikum koncentrációjának. A 94651 számú japán szabadalmi leírás szerint a PS—5 antibiotikum-nátrium-só E^° értéke 301 nm Xmax-nál 267,5. Ha a készítmény nem tartalmaz- 50 na kristályvizet epszilon értéke 8560 lenne. Mivel a PS—5 antibiotikum optikai sűrűsége 301 nmnél az eredeti érték 5%-ára csökken, még a hidroxilaminnal vagy [í-laktamázza! történő teljes lebomlás után is, így ennek a szubsztrátumnak optikai sűrűség 55 különbségét 301 nm-nél Ae=8132 értéknek vettük. Ezt vesszük alapul a PS—6 antibiotikum vizsgálatánál is. Az eredmények ennek megfelelően az alábbiak. (C) Eredmény 60 (a) Bacillus licheniformis 749/C exo-penicillinase. Fél milliliter fenti enzimkészítményt és 30 m [xmól PS—6 antibiotikumot tartalmazó szubsztrátum-oldatot összekeverünk (a PS—6 antibiotikum végső koncentrá- 65 ciója 10 pmól/ml=3,3 ;xg/ml; kezdeti optikai sűrűség 18
