179727. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmény előállítására
5 179727 6 pórusátmérővel rendelkező hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 20—50 mg, előnyösen 25 mg glükóz-izomérázt tartalmaz. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa A hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: Nátriumszilikát-oldatból kénsavval kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt vízgőzzel telített levegőben 3 órán át 180 C3-on szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 80%-os relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 730 C°-on hevítünk. Az így kapott hordozóanyag (I. hordozóanyag) leggyakoribb pórusátmérője 1400 Â. Az 1. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25—0,5 mm szemcseméretű frakcióval hajtjuk végre. 150 g, a fentiek szerint előállított hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos y-amino-propil-trietoxiszilán-oldatot adunk, és azelegyet 8 órán át visszafolyatás közben forraljuk. Lehűlés után a szilárd anyagot 3 < 1000 ml benzollal és 3 x 1000 ml acetonnal mossuk. Az oldószert szobahőmérsékleten, vákuumban lepároljuk, és a kapott hordozóanyagot 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) kétszer, majd kétszer desztillált vízzel háromszor mossuk. A hordozóanyagot vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. A szén- és nitrogéntartalom meghatározásakor kapott átlagértékek szerint az 1. hordozóanyag 0,13 mólekvivalens/g szilánt tartalmaz. ( 10 g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglükozidázt (Merck 1330) tartalmazó 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk. A felhasznált amiloglükozidáz aktivitása 11,75 egység/mg (1 egység -^az enzim 1 perc alatt 25 C’-on 1 'jimól glükózt fejleszt). A szuszpenziót 20 percig vákuumban tartjuk, majd ismét levegőztetjük, és 2 óra elteltével újabb 20 percre vákuum alá helyezzük. 4 óra elteltével a hordozóanyagot kiszűrjük, kétszer desztillált vízzel háromszor, majd 0,01 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=5) háromszor mossuk, végül a kapott mintát (1.1. minta) 4 C=-on foszfátpuffer-oldatban (pH=5) tároljuk. Szén- és nitrogénelemzés alapján a minta fehérjetartalma 16,5 mg/g. 10 g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott 1. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merch 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk. A szuszpenziót az 1.1. minta előállításánál ismertetett módon dolgozzuk fel. Az így kapott minta (1.2. minta) szén- és nitrogénelemzés alapján 9,0 mg/g fehérjét tartalmaz. 2. példa A hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: nátriumszilikát-oldatból kénsavval kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt az 1. példában ismertetett módon szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 80% relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 680 C -on hevítünk. A kapott hordozóanyag (2. hordozóanyag) leggyakoribb pórusátmérője 340 Â. A 2. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25-— 0,5 mm szemcseméretű frakcióval végezzük. 150 g, a fentiek szerint kapott hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos y-amino-propil-trietoxiszilán-oldatot adunk, és az elegyet az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 2. hordozóanyag a szén- és nitrogénelemzés átlagértékei alapján grammonként 0,19 mólekvivalens szilánt tartalmaz. 10 g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglükozidáz (Merck 1330) 20 ml, 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpéndálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 2.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 30,8 mg fehérjét tartalmaz. 10 g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott 2. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merck 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 1.2. minta előállításánál közöltek szerint kezeljük. A kapott 2.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 17,4 mg fehérjét tartalmaz. 3. példa A 3. hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: nátriumszilikát-oldatból kénsavval kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt az 1. példában ismertetett módon szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 60% relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 640 C°-on hevítünk. A kapott 3. hordozóanyag leggyakoribb pórusátmérője 180 Â. A 3. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25—0,5 mm szemcseméretű frakcióval végezzük. 150 g, a fentiek szerint kapott hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos y-amino-propil-trietoxi-szilán-oldatot adunk, és az elegyet az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3. hordozóanyag a szén- és nitrogénelemzés átlagértékei alapján grammonként 0,51 mólekvivalens szilánt tartalmaz. 10 g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglükozidáz (Merck 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 26,2 mg fehérjét tartalmaz. 10 g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott 3. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merck 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3.2. minta szén- és nitrogcnelemzés alapján grammonként 12,7 mg fehérjét tartalmaz. 4. példa A 2. hordozóanyagból szitálással elkülönítjük a 0,25— 0,5 mm szemcseméretű frakciót. 50 g így elkülönített, 340 Â leggyakoribb pórusátmérőjű hordozóanyag-frakciót 500 ml 12,5%-os vizes glutárdialdehid-oldathoz adunk, és az elegyet 5 percig szobahőmérsékleten kever-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
