179727. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmény előállítására
7 179727 8 jük. Ezután az elegéhez 500 ml telített, vizes ammóniumklorid-oldatot adunk, és az elegyet 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a szilárd anyagot leszűrjük, vízzel kloridmentesre-mossuk, és vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. 10 g így kapott hordozóanyagot 1 g amiloglükozidáz (Merck 1330) 20 ml 0,05 mqlos foszfátpuffep-oldattal (pH.=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. Az így kapott 4.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 29,8 mg fehérjét tartalmaz. További ló g, az előzőek szerint előkezelt 2. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merck 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában az 1.2. minta előállításánál közöltek szerint kezeljük. A kapott 4.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 17,9 mg fehérjét tartalmaz, A 4.1. és 4.2. mintával végzett kísérletek eredményei —i amelyeket a későbbiekben ismertetünk — azt igazolják, hogy a kapcsolószer minősége semmiképpen nem befolyásolja az enzimkészítmény aktivitását. 5. példa 10 g 1. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 1400 Â) 0,5 g glükóz-izomeráz [Y. Takasaki: Agr. Biol' Chem 33, Nr. 11, 1527—1534 (1969)] 40 ml 0,05 mólos,foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk. A szuszpenziót 30 percig szobahőmérsékleten tartjuk. A reakcióedényt 10 percenként evakuáljuk, majd a reakció lezajlása után az oldat maradékát leszívatjuk. A szilárd anyagot vízzel és 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) háromszor mossuk. Az így kapott 5.1. minta szén-és nitrogénelemzés alapján grammonként 4,8 mg fehérjét tartalmaz. Az 5.2. minta előállítása során 10 g 1. hordozóanyagot 40 m) 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7), amely 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmaz, szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1, minta előállításánál ismertetett módon kezeljük. A kapott 5.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 2,0 mg fehérjét tartalmaz. , • • . 6. példa J0 g 2. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 340 Â) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk. A szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. Az így kapott 6.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 22,0 mg fehérjét tartalmaz. A 6.2. minta előállítása során 10 g 2. hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 6.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 10,2 mg fehérjét tartalmaz. 7. példa 10 g 3. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 180 Â) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. Az így kapott 7.1. minta szén- és niírogéneiemzés alapján grammonként 11,2 mg fehérjét tartalmaz. A 7.2. minta előállítása során 10 g 3. hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1. minta előállításánál ismertetett módon kezeljük. A kapott 7.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 5,1 mg fehérjét tartalmaz. 8. példa 10 g, a 4. példában ismertetett hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 340 Â; vizes glutárdialdehidoldattal kezelt anyag) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 8.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 21,3 mg fehérjét tartalmaz. A 8.2. minta előállítása során 10 g, a fentiekben közölt minőségű hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH= =7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1. minta előállításánál megadottak szerint kezeljük. A 8.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 9,8 mg fehérjét tartalmaz. 9. példa Az 1—4. példában ismertetett 1.1., 1.2., 2.1., 2.2., 3.1., 3.2., 4.1. és 4.2. minta, valamint a hordozóanyagon rögzített szabad enzim (amiloglükozidáz, Merck 1330) aktivitását dinitrpszalicilsavas módszerrel határoztuk meg [Rick, V., Stegbauer, H. P.: Meth. d. Enzymatischen Analyse (szerk.: Bergmeyer, H. U., kiadó: Verlag Chemie 1970), 848, és következő oldalak]. Egy aktivitási egységnek (U) azt az enzimmennyiséget tekintjük, amely az inkubálás körülményei között percenként 1 mikroekvivalens redukálandó csoportot (glükózt) szabadít fel. Az inkubálást a következő körülmények között végeztük: 2%-os szubsztrátum-oldat (Zulkowsky-keményítő, Merck 1257); oldószer: 0,1 mólos acetát-puffer (pH = 5,0) ; hőmérséklet : 25 C° ; reakcióidő : 30 perc. A hordozón rögzített enzimkészítményeket 40 ml-es reaktorba mértük be, és a szuszpenziót a fenti körülmények között 600/perc sebességgel kevertük. A termék képződési sebessége független a keverés sebességétől. Az enzimkészítmények fehérjetartalmát a szén- és nitrogénmeghatározáskor kapott átlagértékek alapján számítottuk ki. A hordozóanyagok leggyakoribb pórusátmérőjét a póruseloszlás vizsgálatakor kapott adatokból határoztuk meg. A póruseloszlást nagynyomású poroziméter felhasználásával határoztuk meg. Az 1.1.—4.2. minta jellemző adatait az 1. táblázatban soroljuk fel. Az 1. táblázatban felsorolt rövidítések jelentése a következő: D: leggyakoribb pórusátmérő, Â, CE: enzimfelvétel, mg enzim/g hordozóanyag, U : aktivitás, egység/g minta, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
