179726. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtfalvázat tartalmazó szilárd gyógyszerkészítmények előállítására
5 179726 6 piás célokra nem használható fel és el kell önteni. A találmány szerint azonban könnyen és nagy mennyiségben állítható elő az olajhoz kötött SFV adott kis menynyiségét tartalmazó szilárd készítmény, melynek minősége kontrollálható. Ami a találmány szerinti szilárd készítményből előállítható szuszpenzió nagyobb stabilitását és aktivitását illeti (e jelenségeket fentebb a találmány egyik érdemeként, illetve váratlan és meglepő tulajdonságaként írtuk le), e megtartott nagyobb stabilitás és hatásosság feltehetően annak tulajdonítható, hogy az olajhoz kötött SFV egyenletesen oszlatható el a szilárd készítményből előállított szuszpenzióban és a diszpergált, olajhoz kötött SFV finom (körülbelül 5 p. átmérőjű) gömböcskék formájában van jelen anélkül, hogy azok nagyobb részecskékké tapadnának össze. A találmány fenti értelmezéséből következően meg kell jegyezni és hangsúlyozni kell, hogy a találmány — elsőnek a világon — legyőzi ázokat"a nehézségekét és akadályokat, amelyek lehetetlenné tetítyk, .típfey ipari szinten^ jó minőségben tumorgátló szert készítsenek az olajhoz kötött SFV-bőI. A találmány szerint ez kényelmesen végrehajtható és így lehetővé válik' az SFV gyakorlati Kórházi alkalmazása. Ez a tény korszakalkótó és ázt jelenti, hogy á találmány jótétemény lesz a rákos betegek számára. ....... A tálálrriány szerinti szilárd gyógyszerkészítmény elméleti és technikai előnyeinek bemutatása és alátámasztása céljából az alábbiakban ismertetjük az elvégzett gyógyszertani és gyógyszerészeti próbák eredményeit 2 Anyag és módszer Adjuvánsok: a Nocardia rubra (a továbbiakban N. rubra) SFV-jének előállítását fentebb leírtuk. Az.N. rubra olajhoz kötött SFV-jének előállításához használt olajak: Drákeol 6VR (Pennsylvania Refining Co., Butler, USA), szkvalén (Tokyo Kaséi Co., Ltd., Japán) és szkvalán (Kataÿâma Kagaku Ltd., Japán). Antigének : m-[4-(4'-monófenil-azo)-fenil]-N-acetil-L-tirozint (ABA-N-acetil-tirozin) és ABA-bakteriális a-amilázt (ABA-BaA) a J. Biol. Chem. 238, 1726—1730 (1959) közleményben leírt módszer szerint állítunk elő. A Bacillus subtilisból tisztítás után nyert bakteriális a-amiláz (Liquefying Type, Lot No. E5X01) beszerzési forrása: Seikagaku Kogyo Co., Ltd., Japán. Daganatok: CB7BL/6J egerek leukémia EL4-ét, DBA/2 egerek P815—X2 masztocitomáját, BALB/c egerek Meth A tumorát, C57BL/6J egerek 3-metiI-koláhtrénnel indukált fibroszarkomáját (MC 104) használjuk. Az EL4-et, a P815—X2 masztocitomát és a Meth A-t az aszcitesz-formájú tumoroknak a megfelelő szüngén nőstény egerekbe való sorozatos átoltásával tartjuk fenn. Az MC104-et szüngén egerekbe való sorozatos 5 szubkután transzplantációval tartjuk fenn. Egerek: a BALB/c, C578BL/6J és DBA/2 törzsű, 6—8 hetes nőstény egerek beszerzési forrása: Shizuoka Jikken Dobutsu Nokyo, Shizuoka, Japán. Az állatoknak ad libitum adunk eleséget (Oriental Yeast Ind., 10 Japán) és vizet. Táptalajok: 100 E/ml penicillint és 100 izg/ml streptomycint tartalmazó „Eagle’s minimal essential medium” (MEM) (=minimálisan elegendő tápanyagokat tartalmazó táptalaj) (Research Foundation for Microbial 15 Diseases, Osaka University, Japán). Szövettenyésztéshez RPMI—1640 médium (Nissui Seiyaku Co., Ltd., Japán). A fötális borjúsavót (Lof No: 4055722) (Flow Laboratories, Rockwille, USA) használat előtt 56 °C-on 30 percig melegítve inaktiváljuk. ' 20 Direkt citotóxicitás vizsgálata: MEM-mel készült tumorsejt (Meth A) szuszpetíziót elkeverünk egyenlő térfogatú, olajhoz kötött SFV-vel váéy olajcseppecskékkel és jéghideg vízfürdőben tartjuk 60 percig. A tűmorséjtek élet képességét Eösin Y festési próbával határozzuk meg 25 (az eozin Y csak a membránkárosult sejteket festi meg). A késői típusú hiperszenzitivitás kialakulására gyakorolt adjuváns hatás meghatározása : Tengérímalacok primer immunizálását hajtjuk végre olyan módon, hogy négy talpukat összesén 50 u,g ABA-N-acetil-tirozinnal 30 kezeljük N. rubra-ból származó SFV különböző vivőolajokkal . képezett' olaj-a-vízben emulziójával együtt, vagy iz utóbbi nélkül. Két hét múlva 100 p.g ABA-BaA antigénnel bőrpróbát végzünk és a reakciót az antigén infradermális injekciója után 24 és 48 óra múlva érté- 35 keljük. Sejt közvetítette citotoxicitás vizsgálata: C57BL/6J egereket (H—2b) intraperitoneálisan immunizálunk masztocitoma P815—X2 (H—2d) életképes sejtekkel N. rubra-ból származó, olajhoz kötött SFV-vel együtt vagy 40 az utóbbi nélkül. Az immunizálást követő 11. napon elvégezzük a sejt közvetítette citotoxicitás vizsgálatát immunizált egerek lépsejtjeivel és 51Cr-izotóppal jelzett maszrocitoma P815-—X2 sejtekkel, Brunner és munkatársai eljárását alkalmazva [Immunology 18, 501—515 45 (1970)], bizonyos módosításokkal [T. Taniyama és munkatársai, Jpn. J. Microbiol. 19, 255—264 (1975)]. A Iépsejtek (effektor-sejtek) és az 5ICr-jelzett masztocitoma P815 — X2 sejtek („céltábla”- vagy target-sejtek) aránya 100:1. A „célsejtek” lízisét mint százalékos specifikus 50 „célstjff’-lízist adjuk meg a következő képlet szerint: Specifikus „célsejt”-1ízis %= specifikus „célsejt”-lízisnél mért izotóp-felszabadulás x 100 maximális izotópfelszab. — spontán izotópfelszabadulás A maximális 5,Cr-felszabadulást teljes sejtpusztulásnál határozzuk meg, amikor a „célsejteket” magukban kétszer lefagyasztjuk és felengedtetjük. N. rubra olajhoz kötött SVF-jének előállítása: az N. rubra-ból származó SFV-bőI az alábbi példák szerint állítunk elő szilárd készítményt. Eredmények Különböző olajokkal kezelt N. rubra—SFV hatása a sejt közvetített citotoxicitásra allogén egereknél: N. rubra-ból származó SFV-t szklavénnel vagy^Drakeol 6VR-rel kezelünk és 0,2% Tween—80-at tartalmazó 55 0,9%-os konyhasóoldatban szuszpendáljuk. C57BL/6J egereket masztocitomaséjtek és adjuvánsok keverékével immunizálunk, a fentebb leírtak szerint. Amint az I. táblázatból látható, Drakeol 6VR-sóoldattal, szkvalénsóoldattal vagy szkvalén-mannittal kezelt N. rubra- 60 SFV-készítmények igen hatásosan adjuválják az effektor-sejtek képződését allogén egerek lépjében. Azt is kimutattuk, hogy a liofilizált adjuvánsok, melyeket sterilizált víz hozzáadásával használat előtt újraszuszpendálunk, ugyanolyan hatásosak, mint a használat előtt 65 frissen előállított adjuvánsok. 3
