179672. lajstromszámú szabadalom • Eljárás liposzómák vizes oldatának előállítására
9 179672 10 hidrofil csoport (a foszfatidil-kolin rész) a hólyagocskák belseje felé, a hidrofób csoport (a szénhidrogén-lánc) kifelé irányul és a szerves oldószerrel érintkezik. A mikroszkopikus hólyagocskák kolloid szuszpenziót képeznek a szerves oldószerrel, amely oldott állapotban tartalmazza a felületaktív anyag fölöslegét. Ezután a szerves oldatot betöltjük egy másik edénybe, amely 30 ml 0,9%-os semleges vizes nátriumklorid oldatot tartalmaz. A keveréket nagy sebességű keverővei 30 C hőmérsékleten emuigeáljuk. Ekkor egy olyan diszperziót kapunk, amelyben a szerves oldószer finom cseppecskéi helyezkednek el a vizes fázisban. Minden cseppecskében szuszpendálva van a fent leírt liposzómaprekurzor és a lipid fölöslege. Az edénybe egy megfelelő csövön át levegőt vezetünk oly módon, hogy a légáram a 30 C hőmérsékleten kevert emulzió felületének közvetlen közelében haladjon el. A levegő és az oldószergőzök keverékét egy-kondenzátorban 10 °C-ra hűtjük le, anrikorisa gőzök kondenzálódnak. Ezt a műveletet addig folytatjuk, amíg megszűnik a gőzök lecsapódása a kondenzátorban (mintegy 20—30 perc). Ezután az edényben mintegy 20 ml tiszta oldat (0,9%-os nátriumklorid-oldat) marad vissza. A liposzómák kapszulái hólyagocskák alakjában vannak szuszpendálva a folyadékban. Falaik a felületaktív anyag molekuláinak kettős rétegéből állnak, ahol a molekulák azonos minőségű végei egymás felé, másik végei kifelé állnak. A fal külső rétege a szerves oldószerben oldott lipid-fölöslegből képződött, amikor a rendszert bepároltuk. A liposzóma-oldat 2 ml-ét 2,5 g sephadex G—50-et tartalmazó oszlopon kromatografáljuk (az eíuálószer 0,15 mólos vizes nátriumklorid+0,05 mólos foszfátpufifer, pH 7,5). Az eluátum spektrometrikus elemzésével megállapítottuk, hogy az eredeti inzulin-oldatnak mindössze 20—25°o-a rekedt kívül a liposzómákon. Ezért az e példa szerint előállított liposzóma-oldatot a legtöbb esetben minden további tisztítás nélkül fel lehet használni a gyógyászatban. 2. példa Egy 10 g/liter töménységű amiioglukozidáz-oldatot kapszulázunk be és diszpergálunk 0,15 mólos nátriumklorid oldatban az alábbiak szerint: 74 mg lecitin, 0,1 ml amiloglukozidáz-oldat és 3 ml diizopropiléter keverékét 2 percig kezeljük ultrahang-besugárzással (20 kHz, 150 W), miközben hőmérsékletét hűtőfürdővel 30 °C alatt tartjuk. Tiszta homogén kékesszínű folyadékot kapunk. Ehhez hozzáadunk 15 ml 0,15 mólos vizes nátriumklorid oldatot. A keverékét az 1. példa szerinti módon emuigeáljuk. A finom emulziót nitrogénárammal fúvatjuk a szerves oldószer elpárologtatására. A fúvatást a bepárlás befejeződéséig (mintegy 20—30 percig) folytatjuk. Kolloid méretű liposzómák tiszta szuszpenzióját kapjuk. A liposzómákba az amiloglukozidáz oldat van bezárva. A diszpergálószer, a 0,15 mólos nátriumklorid oldat igen kis mennyiségű (mintegy 5%) kívülrekedt enzimet tartalmaz. A kapott oldatot az alkalmazás céljától függően használhatjuk úgy mint van, vagy a be nem kapszulázott amiloglukozidáznak például Sepharose gélen való kromatográfiával való eltávolítása után. 3. példa Megismételjük az 1. példa szerinti eljárást, azzal az eltéréssel, hogy ezúttal 0,05 ml mennyiségű, 0,5 mg/ml koncentrációjú arabinóz-citozin oldatot kapszulázunk be, amelyet 10 mmólos vizes foszfátpuflerrel (pH 7,2) készítettünk. Diszpergálószerként 0,15 mólos nátriumklorid oldat 10 ml-ét használjuk, míg lipidként 47 mg kardiolipint, szerves oldószerként pedig 2,4 ml dibutilétert és 0,6 ml kloroformot alkalmazunk. 4. példa Az 1. példában ismertetett módon 0,1 ml mennyiségű 100 mg/ml koncentrációjú penicillinamin oldatot kapszulázunk be. A diszpergáló közeg 0,15 mólos vizes nátriumklorid oldat, a felületaktív anyag 105 mg lecitin és 35 mg koleszterin, az oldószer 3 ml butilacetát. 5. példa Az 1. példa szerinti módon bekapszulázzuk betametazon vizes dinátriumfoszfáttal készített 150 mg/liter töménységű oldatának 0,05 ml-ét. Diszpergálószerként 0,15 mólos vizes nátriumklorid oldatot, lipidként 85 mg lecitint és 45 mg foszfatidil-etanolamint, oldószerként 3 ml 3-heptanont használunk. 6. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg, azzal az eltéréssel, hogy a poliinozinsav-policitidilsav [poli(I)-poli(C)] savkomplex 1 mg/ml koncentrációjú vizes oldatának 0,1 ml-ét kapszulázzuk be. Diszpergálószerként 0,15 mólos nátriumklorid oldatot, felületaktív anyagként 60 mg lecitint, 20 mg sztearilamint és 15 mg koleszterint, oldószerként diizopropiléter és butilacetát 1 : 1 arányúelegyének 3 ml-ét használjuk. 7. példa 20 ml diizopropiléterhez hozzáadunk 1,5 g lecitint, 0,4 g foszfatidil-szerint és 0,5 g koleszterint, majd 1,8 mg aktinomicin D 3 ml 0,1 mólos, 7-es pH-jú foszfátpufferrel készített oldatát. A keveréket az 1. példa szerinti módon sugározzuk be ultrahanggal 5 percig. Ezután 100 ml vizes foszfátpuffert adunk hozzá (0,1 mólos, pH 7), és a rendszert az 1. példában ismertetett módon emuigeáljuk. Az emulgeáló keverő leállítása nélkül összekötjük az edényt egy vákuumcsappal, és a nyomást fokozatosan 10 torr-ra csökkentjük. Eközben az elegy hőmérsékletét 20—22 °C-on tartjuk. Mintegy 45 perc múlva a diizopropiléter teljesen eltávozik, és visszamarad a tiszta liposzóma-oldat. A termék egy mintáját sephadexen kromatografáltuk és meghatároztuk hatóanyagtartalmát. Azt találtuk, hogy az eredeti aktinomicin D 88/o-a a liposzómákba került. 8. példa 1 g tripszin 30 ml 0,1 mólos (pH 7) foszfátpufferrel készített oldatát 30 g foszfatidil-inozit 100 ml dipropiléterrel készített oldatának jelenlétében ultrahanggal kezeljük. Ezután 460 ml 0,5%-os vizes nátriumklorid oldatot adunk hozzá, és a rendszert emuigeáljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
