179657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eszterasztin és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
9 179657 10 A Triton X—100 polietilénglikol-alkilfeniléter'oől álló emulgálószer kereskedelmi neve (Rohm and Haas, Co. USA). 0,03 ml lipáz oldatot, 2,92 ml 0,05 M foszfát puffer oldatot (pH=7,0) és 0,025 ml eszterasztin vizsgálandó mintát tartalmazó oldatot összekeverünk és a kapott 2,975 ml elegyet 3 percig 20 °C-on melegítjük, majd 0,025 ml 10 mg/ml p-nitrofenil-acetát metanolos oldatával összekeverjük és így beindítjuk a p-nitrofenil-acetát reakcióját a lipázzal. Miután a reakciót 20 °C-on 30 percig elvégezzük, a kapott oldat abszor'ocióját (a) 400 nm-nél mértük. Másrészről 400 nm-nél azonos módon mértük az eszterasztint nem tartalmazó kontroll oldat abszorpcióját (b), amelyet 0,05 M foszfát puffer oldatból kaptunk. A következő egyenlet alapján számítottuk ki az észteráz gátló hatást : (b-a) Gátlás (%)=--------+100. b Az elemzési módszer szerint az alábbiakban következő 7. példában leírt színtelen eszterasztin por olyan hatású, hogy az ID50, azaz az 50%-os észteráz gátlást adó dózis: 0,0002 mcg/ml. Az eszterasztin tenyésztését fermentorban vagy rázótenyésztési módszerrel végezhetjük. így például 250— 300 liter 1,5% Pharma-táptalajt, 15% glicerint, 0,3% nátrium-kloridot és 0,2% L-aszparagint tartalmazó folyékony táptalajt 570 literes fermentorba helyezünk, sterilizáljuk az elegyet, majd a táptalajt beoltjuk MD4—Cl törzs ferde tenyészetével 10%-os inokulum méretre, ezalatt 250—300 liter/perc sebességgel steril levegőt engedünk a 200 peicenkénti fordulatszámú keverővei kevert táptalajba. Az inkubálási hőmérséklet 27 °C. A kísérletben az eszterasztin termelés 48—72 órás inkubáció után érte el a maximumot. A termelt eszterasztin a fermentlében és az MD4—Cl törzs micéliumaiban van jelen. Az MD4—Cl törzs tenyészetéből az eszterasztin kinyerése úgy történik, hogy a fermentlevet leszűrhetjük és az eszterasztint tartalmazó micéliumokból álló szűrési kalácsot vízzel elegyedő szerves oldószerrel, például metanollal, etanollal és acetonnal extrahálhatjuk. Az eszterasztint a micéliumokból úgy nyerhetjük ki, hogy a micélium kalácsot kétszer 5—10-szeres térfogatú metanollal extraháljuk és így az eszterasztin átkerül a micéliumokból a metanolos fázisba. A kapott metanolos kivonatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és a maradékot szerves oldószerrel, mely jól oldja az eszterasztint, például kloroformmal, acetonnal, benzollal, butilacetáttal vagy etilacetáttal extrahálhatjuk. Ha az eszterasztint nagytérfogatú fermentlé szűrletből kell elkülöníteni, akkor a fermentlé szűrletet célszerű vízzel nem elegyedő, az eszterasztint jól oldó szerves oldószerrel, például butilacetáttal extrahálni és így az eszterasztint átoldjuk a szerves oldószeres (butilacetátos fázisba). Ha fél térfogat butilacetáttal kétszer extraháljuk a fermentlevet, rendszerint gyakorlatilag a szűrt fermentlében levő egész jelenlevő eszterasztin mennyiséget átvihetjük és átoldhatjuk a butilacetát fázisba. Az eszterasztin extrahálását és tisztítását az ismert ellenáram elve alapján is végezhetjük, oly módon, hogy két eszterasztint oldó, de egymással nem elegyedő oldószert alkalmazunk. Ha a butilacetátban levő extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, eszterasztint tartalmazó nyers port kapunk. Jó termeléssel kapjuk az eszterasztint akkor is, ha az oldott állapotban eszterasztint tartalmazó oldatot adszorbenssel kezeljük, majd az adszorbenst kezeljük és az eszterasztint deszorbeáljuk. Adszorbensként előnyösen Amberlite XAD-ot (nem-ionos, igen porózus gyanta, Rohm and Haas Co., USA) és szervetlen adszorbenst, például aktív szenet, alumíniumot, szilíciumdioxidot és magnéziumszil ikátot használhatunk (Frorigil). Az eszterasztint például szilikagélen adszorbeálhatjuk és kloroform és metanol 80: 1 térfogatarányú elegyével eluálhatjuk. Amikor az MD4—Cl törzs micéliumok metanollal történő extrahálásával, a metanolos kivonat szárazra párlásával, a maradék butilacetáttal történő extrakciójával és a kivonat koncentrálásával kapott nyers port szilikagélen kromatografáljuk, majd kloroform és metanol 80: 1 arányú elegyével eluáljuk, az eszterasztint 90%-os vagy jobb termeléssel kapjuk. Az eszterasztin tisztítását előnyösen a nyers eszterasztin por szilikagéles kromatografálásával végezhetjük. így például gyakorlatilag tiszta eszterasztint kaphatunk, ha a nyers eszterasztin port száraz szilikagélen kromatografáljuk, etilacetáttal, mint előhívószerrel eluáljuk. Az így kapott, gyakorlatilag tiszta eszterasztint még tovább tisztíthatjuk, ha megfelelő oldószerből vagy elegyből, például kloroform és petroléter elegyből átkristályosítjuk és így a tiszta eszterasztint színtelen por formájában izolálhatjuk. Az eszterasztin tisztítását végezhetjük Sephadex LH—20-on való kromatografálással is (gélszűrőszer, Pharmacia Co. Svédország). A találmány szerint előállított eszterasztin fizikaikémiai és biológiai tulajdonságait az alábbiakban részletezzük. A színtelen por alakú eszterasztin 90—95 °C-on olvad és fajlagos optikai forgatóképessége [a]p +11° (c 1, kloroform). Analízis: C=67,04%, H=9,21%, N=5,56% és 0=17,90%. Az 1. ábra mutatja az eszterasztin 0,1 mg/ml koncentrációjú metanolos oldatának UT abszorpciós spektrumát és 230 nm-nél mutat abszorpciós csúcsot (E}*=22,5). A káliumbromidban mért infravörös abszorpciós spektrumot a 2. ábra mutatja és eszerint a jellegzetes abszorpciós sávok a következő hullámhosszoknál jelentkeznek: (cm“1): 3470, 3350, 2950, 1840, 1730, 1645, 1610, 1545, 1415, 1375, 1325, 1260, 1225, 1185, 1115, 1040, 1020, 975, 920, 900, 880, 840, 810 és 690. Az NMR-spektrumot deutero-kloroformban mérjük 100 MHz-nél, belső standardként tetrametilszilánt alkalmazunk és az eredményeket a 3. ábra mutatja. Az eszterasztin tömegspektrogramja m/e. 506 értéknél mutatja a molekuláris ioncsúcsot. A molekuláris ioncsúcsból és az analízis értékekből következtetve az eszterasztin tapasztalati képlete: C28H46N206- Ezt a képletet igazolja a nagyfelbontású tömegspektrográfia (talált érték : m/e). 506, 3364, számított molekulasúly C28H46N206 képlet alapján: 506, 3354. A mellékelt rajzokkal kapcsolatban : az 1. ábra az eszterasztin metanolos oldatának UI abszorpciós spektrumát, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
