179657. lajstromszámú szabadalom • Eljárás eszterasztin és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
11 179657 12 a 2. ábra az eszterasztin káliumbromidban mért IV abszorpciós spektrumát és a 3. ábra az eszterasztin 100 MHz-nél deutero-kloroformban mért abszorpciós spektrumát mutatja. Az eszterasztint ón sósavban 100 °C-on 18 óra hosszat hidrolizáljuk és a kapott hidroiizátumot aminosavas analízisnek vetjük alá és aszparaginsavat találunk. Az eszterasztin könnyen oldódik piridinben, dimetilszulfoxidban, metanolban, etanolban, acetonban, etilacetátban, butilacetátban, kloroformban és benzolban, de lényegében nem oldódik vízben, petroléterben és hexánban. Az eszterasztin pozitívan reagál a Rydon—Smith reakcióra. Dragendorff reakcióra és a jódpára reakcióra, de negatívan reagált az Ehrlichreakcióra, ninhidrin reakcióra és a Sakaguchi reakcióra. Silica Gel G-n végzett szilikagél kromatográfia alapján az Rf érték 0,6, ha kloroform-metanol-víz 10:1: 0,05 eleggyel hívjuk elő és 0,2, ha etilacetáttal hívjuk elő. Az eszterasztin nem mozog magas feszültségű papír elektroforézisban (3500 volt, 15 perc), ha hangyasav—ecetsav—víz 25:75:900 elegyét használjuk. A találmány szerint előállított eszterasztin toxicitása igen alacsony, ezt az támasztja alá, hogy egyáltalán nem figyeltek meg toxicitást, amikor az akut toxicitás megállapítására 250 mg/kg (intraperitoneális injekció) dózist adtunk egereknek. Az eszterasztin 0,0002 mcg/ml koncentrációban 50%-ban gátolja a sertés pancreas észterázt (ID50). Az ismert észteráz gátló anyagok közül megemlíthetek a paraoxon és a diizopropil-fluorofoszfát, amely igen toxikus vegyület. Az eszterasztin nem toxikus és erősen gátolja az észterázt olyan mértékben, hogy 4,lxlO-líM eszterasztin 50%-ban gátolja az észterázt, ha p-nitrofenil-acetátot használunk szubsztrátumként. ’Az eszterasztin új anyag. A további kísérletek során azt találtuk, hogy az eszterasztin élő állatokon befolyásolja az immunválaszt. ' Az eszterasztin immúnreakcióra kifejtett hatását a következő módon vizsgáltuk : 1. Humorális antitestek képződésére gyakorolt hatás dd/Y egerek csoportját (csoportonként 5 db 6—8 hetes nőstény egeret) I08 juh vörös vérsejttel, mint antigénnel (fiziológiás só oldatban készített szuszpenzió formájában) intravénás injekció útján immunizáltuk, hogy kifejlesszük az immunitást. Ugyanakkor 1 mg, 250 meg, 62,5 meg vagy 15,6 meg eszterasztint injekcióztunk be intraperitoneálisan (1% DMSO-só szuszpenzió formájában) egerenként az egyes egércsoportoknak. Az immunizálás utáni 4. napon az egereket leöltük, a lépet ingereltük és Jerne (lásd N. K. Jerne, A. A. Nordin és C. Henry : „The agar plaque technique for recognizing antibody-producing cells. Cell-bound Antibodies” e. B. Amos és H. Koprowski 109—122., Wister Institute Press. Philadelphia, 1963) módszere alapján határoztuk meg az egérlépekben jelenlevő antitest-képző sejtek számát. A kísérletek eredményét az alábbi 2. táblázat mutatja. 2. táblázat Eszterasztin hatása az antitest-képződésre Antigen Eszterasztin dózis egerenként Antitest-képző sejtek száma iépenként 108 JWS* 0 170 000 + 10 400 108 JVVS 1 mg 45 300 ± 3300 108 JVVS 250 meg 52 000+2300 108 JVVS 62,5 meg 55 000 + 5700 108 JWS 15,6 meg 173 000 + 19 600 * JVVS juh vörösvérsejt ** S.H. standard hiba , A fenti táblázat azt mutatja, hogy ha 1 mg—62,5 meg eszterasztint adagolunk be egereknek, akkor az antitest képző sejtek száma jelentősen csökken. 2. Celluláris immunitásra gyakorolt hatás Az eszterasztin celluláris immunitásra gyakorolt hatását az ismert Késleltetett Típusú Túlérzékenység módszer szerint vizsgáltuk (K.T.T.) lásd P. H. Lagrange, G. B. Mackaness és T. E. Mille: „J. Exp. Med.”, 139, 1529—1539. (1974) és juh vörösvérsejttel, mint antigénnel immunizált egereket alkalmaztunk. így 0,05 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendált 108 juh vörösvérsejtet a dd/Y egerek hátsó talpába egyik oldalon adott szubkután injekcióval (csoportonként 5 nőstény egér, 6 hetes) immunizáltunk, hogy létrehozzuk a késleltetett típusú túlérzékenységet. Az immunizálással egyidejűleg 1 mg/egér, 250 meg/egér, 62,5 meg/egér vagy 15,6 meg/egér eszterasztint injektálunk be intraperitoneálisan minden tesztegérnek. 4 nappal később 108 juh vörösvérsejtet injekcióztunk be minden teszt-egér hátsó lábába a másik oldalon, hogy kiváltsuk a K.T.T. teakciót. Ez után az injekció után 24 órával megmértük a hátsó láb vastagságát mm-ben és így meghatároztuk a juh vörösvérsejtekkel beoltott hátsó lábának megduzzadási mértékét. A megduzzadás mértéke segítségével felmérhetjük a celluláris immunitást. A tesztben kapott eredményeket az alábbi 3. táblázat mutatja. 3. táblázat Az eszterasztin hatása a K.T.T.-re és J.V.V.S.-re egéren Immunizálás Eszterasztin dózis Immunizálást kiváltó injekció Hátsó talp vastagság növekedése (x 0,1 mm) 108 J.V.V.S. 0 (kontroll) 108 J.V.V.S. 8,0 108 J.V.V.S. 1 mg 108 J.V.V.S. 3,8 108 J.V.V.S. 250 meg 108 J.V.V.S. 3,0 108 J.V.V.S. 62,5 meg 108 J.V.V.S. 6,2 A J.V.V.S. jelentése juh vörösvérsejt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
