179599. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-4 antibiotikum előállítására
13 179599 14 0,02-0,02 ml-es aliquotokkal való átitatásuk után olyan agar-lemezekre helyezzük, amelyeket a következőkben felsorolt mikroorganizmusokkal oltottunk be. A P—4 antibiotikum hatástalan az alábbi baktériumokkal szemben: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens és Mycobacterium avium. Másrészt a Talaromyces avellaneus gomba növekedését a P-4 antibiotikum gátolja olyan agar-lemezen, amelynek anyaga 3,5 g nátrium-hidrogén-foszfát, 0,5 g kálium-dihidrogén-foszfát, 5 g élesztőkivonat (a Difco amerikai egyesült államokbeli cég terméke), 10 g glükóz, 15 g agar-agar és 1000 ml 7,0-es pH-jű desztillált víz összekeverése útján állítható elő. Ezen az agar-lemezen tehát a P—4 antibiotikum minimális gátlási koncentrációja 1,0—1,5 pg/ml. Továbbá a Tetrahymena pyriformis W protozoát 20 g proteóz-peptonból (a Difco amerikai egyesült államokbeli cég terméke,'“ 1 g élesztőkivonatból, 2 g glükózból, 1000 ml vízből és 10 ml 7,0 pH-jú 1 mólos foszfátpufferből álló táptalajon 28 °C-on 44-48 órán át tenyésztve, illetve a P—4 antibiotikumnak ezzel a protozoával szembeni gátlási koncentrációját sorozathígításos módszerrel meghatározva megállapítható, hogy a protozoa növekedésgátlása a P—4 antibiotikum 0,5 /ag/ml-es koncentrációjánál következik be. A P—4 antibiotikum hatásos továbbá az alábbi mikroorganizmusokkal szemben: Fusicladium levieri, Helminthosporium sigmoidium var irreguläre, Pyricularia oryzae, Cochlioborus miyabeanus, Sclerotinia screrotiorum, Pellicularia sasakii, Trichophyton rubrum, Rhodotorula rubra és Cryptococcus neoformans. B) Tumorgátló hatás Az intraperitoneálisan 9 egymást követő napon át beadott P—4 antibiotikum terápiái hatását egereken a P388 leukémiával szemben [ a leukémia intraperitoneálisan 1 • 106 sejt/állat arányban lett transzplantálva] vizsgálva megállapítható, hogy a P—4 antibiotikum 0,00625 mg/kg/nap dózisban igen magas, azaz 180%-os túlélést növelő arányt mutat. C) Toxicitás Kísérleti állatként egereket alkalmazva durva akut toxicitási vizsgálatban a P—4 antibiotikumot intraperitoneális injekciók formájában beadva LDS0 értéke 0,313 mg/kg-nál nagyobb. Miként korábban említettük, a P-4 antibiotikum erős gátló hatást fejt ki gombák és protozoák növekedésére, így felhasználható megfelelő gyógyászati készítmények hatóanyagaként. Tekintettel arra, hogy ugyanakkor tumorban szenvedő emlősök, például az egér túlélési idejét növeli, remélhető, hogy tumorgátló gyógyászati készítményekben is használható lesz. A P—4 antibiotikum mint gombák és protozoák növekedését gátló vegyület előnyösen használható például talaj, aktivált iszap vagy állati testnedv bakteriális ökológiájának vizsgálatában. így például ha talajmintából értékes baktériumokat kívánunk izolálni '/agy a baktériumok hatását a gombák és a protozoák Íratásától függetlenül kívánjuk kiértékelni szennyvíztisztításra használt aktivált iszaprendszer működtetése és elemzése kapcsán, akkor a P—4 antibiotikum felhasználható a mintát szennyező gombák és protozoák növekedésének szelektív gátlására a bakteriális flóra zavartalan növekedése mellett. Egy ilyen vizsgálat so_án tipikus módon úgy járunk el, hogy a vizsgálandó mintát hozzáadjuk egy folyékony vagy szilárd táptalajhoz, a kapott keverékhez P—4 antibiotikum 1% metanolt tartalmazó vizes eleggyel készült, 10—100jug/ml koncentrációjú oldatából 0,1 ml-t adunk a táptalaj 1 ml-jére vonatkoztatva és végül az így kapott rendszert inkubáljuk. A P—4 antibiotikum felhasználható továbbá a korábban felsorolt mikroorganizmusok által okozott növényi megbetegedések kezelésére. Ilyenkor jellegzetes módon a P—4 antibiotikum 1% metanolt tartalmazó vizes eleggyel készült, 0,5—5 /ig/ml koncentrációjú oldatát hasznosítjuk. A P-4 antibiotikum felhasználható például rizs esetében üszög, Helminthosporium levélfoltosság és hüvelyragya (sheath blight) kezelésére. A találmányt közelebbről az alábbi kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani. A példákban megadott százalékos értékek vegyes%-os értékek, ha csak másképpen nem jelezzük. 1. példa 200 térfogatrész befogadására alkalmas Erlenmeyer-lombikba bemérünk oltóanyag készítésére alkalmas 7,0 pH-jú táptalajból (1,0% glükózt, 2% Bacto-triptont és 1,2% Bacto-élesztőki vonatot tartalmaz) 40 térfogatrészt, majd sterilizálás után a táptalajt beoltjuk a Nocardia sp. No. C-15003 törzzsel (1FO-13726, ATCC—31281, FERM-P NO. 3992). A tenyészetet ezután 28 °C-on 200 fordulat/perc fordulatszámmal forgó rázógépen inkubáljuk oltótenyészetet kapva. A tenyészetből a sejteket háromszor sterilizált desztillált vízzel mossuk, majd a mosott sejteket az oltóanyag eredeti térfogatának megfelelő térfogatú sterilizált desztillált vízben újraszuszpendáljuk. Az így kapott oltóanyagból ezután egy térfogatrésszel beoltunk 40 térfogatrész olyan fő táptalajt, amely 3% oldható keményítőt, 0,2% ammónium-kloridot, 0,05% magnézium-szulfátot, 1,09% kálium-dihidrogén-foszfátot, 2,09% kálium-hidrogén-foszfátot, 0,001% vas(II)-szulfátot és 0,3% L-leucint tartalmaz. Az így kapott fő tenyészetet ezután 28 °C-on 8 napon át 200 fordulat/perc fordulatszámú forgó rázógépen rázatjuk. A C—15003 antibiotikumok termelt összmennyisége 12 jug/ml, ezen belül az antibiotikumok összmennyiségére vonatkoztatva a P—4 antibiotikum aránya 80 súly%. 2. példa Az 1. példában ismertetett oltótenyészetből 500 térfogatrészt bemérünk egy 2000 térfogatrész űrtartalmú Sakaguchi-lombikba, majd 28 °C-on 48 órán át lengő rázógépen (percenként 110 ütemet tartva) te-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
