179599. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a C-15003 P-4 antibiotikum előállítására
15 i7y5yy 16 nyésztést végzünk oltóanyagot kapva. Ezt az oltóanyagot ezután rozsdamentes acélból készült, 200 000 térfogatrész űrtartalmú fermentorban 100 000 térfogatrész olyan táptalajhoz adjuk, amely 2,0% glükózt, 3,0% oldható keményítőt, 1,0% kukoricalekvárt, 1,0% szójabablisztet, 0,5% Polypeptor márkanevű anyagot (a Daigo Nutritive Chemicals. Ltd. japán cég terméke), 0,3% nátrium-kloridot és 0,5% kalcium-karbonátot tartalmaz, illetve pH-ja 7,0. A tenyésztést 28 °C-on 48 órán át 100 liter/perc nagyságrendű levegőztetés és 200 fordulat/perc fordulatszámú keverés mellett végezzük. A kapott fermentlét ezután teljes mennyiségében hozzáadjuk egy ugyancsak 200 000 térfogatrész űrméretű, rozsdamentes acélból készült fermentorban 100 000 térfogatrész olyan fermentációs közeghez, amely 5% dextrint, 3% kukoricalekvárt, 0,1% peptont, 0,5% L-leucint és 0,5% kalcium-karbonátot tartalmaz, illetve pH-ja 7,0. A fermentálást 28 °C-on 4 napon át 100 liter/perc nagyságrendű levegőztetés és 150 fordulat/perc fordulatszámú keverés mellett végezzük. A C- 15003 antibiotikumok össztermelése 12 jug/ml, ezen belül az antibiotikumok összmennyiségére vonatkoztatva a P—4 antibiotikum mennyisége mintégy 85 súly%. 3. példa A 2. példa szerint előállított fermentléből 95 000 térfogat részhez 50 000 térfogatrész acetont adunk, majd az így kapott elegyet 30 percen át keverjük. Az elegyhez ezután 2000 súlyrész Hyflo Super-Cel márkanevű anyagot (a Johnes and Manville Products, Ltd. cég terméke) adunk, majd az így kapott keveréket alaposan keverjük. A keveréket ezután nyomószűrőn átszűrjük 135 000 térfogatrész szűrletet kapva. A szűrlethez 50 000 térfogatrész vizet és 90 000 térfogatrész etil-acetátot adunk, majd az így kapott elegyet keverés után kétszer extraháljuk. A kapott etil-acetátos fázisok mindegyikét 80 000 térfogatrész vízzel mossuk, majd a fázisokat összeöntjük, 1000 súlyrész vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, szűrjük és 200 térfogatrészre bepároljuk. A koncentrátumhoz petrolétert adunk, majd a kivált csapadékot kiszűrjük 35 súlyrész nyers terméket kapva. Az így kapott nyers termékhez ezután 50 térfogatrész etil-acetátot adunk, majd a kapott keveréket keverjük. Az oldhatatlan részt ezután kiszűrjük, a szűrlethez pedig 10 súlyrész mennyiségben a Merck német szövetségi köztársaság-beli cég által gyártott, 0,05-0,2 mm szemcseméretű szilikagélt adunk. Keverés után az etil-acetátot csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, a maradékot pedig felvisszük szilikagélből készült, 500 térfogatrész űrtartalmú kromatográfiás oszlop tetejére. Az antibiotikumokat ezután szakaszos eluálással különítjük el, az eluálást egymás után 500 térfogatrész n-hexánnal, n-hexán és etil-acetát 3:1 arányú elegyéből 500 térfogatrésszel, n-hexán és etii-acetát 1 : 1 arányú elegyéből 2000 tér foga trésszel és 2000 térfogatrész, vízzel telített etil-acetáttal végezve, és 50—50 ml térfogatrész nagyságú frakciókat szedve. Mindegyik frakcióból 1 térfogatrészt szárazra párolunk, majd a maradékhoz 0,1 térfogatrész etil-acetátot adunk és az így kapott keverékek mindegyikét a Merck német szövetségi köztársaságbeli cég által gyártott 60F25 4 jelzésű, 0,25 mm vastag és 20 x 20 cm méretű, szilikagéllel bevont üveglemez alapvonalától 2,5 cm-re odacsöppentjük, ezután pedig mintegy 17 cm hosszan vízzel telített etil-acetáttal futtatást végzünk. Futtatás után ibolyántúli fénnyel (2357 Â) végezzük a detektálást. A Rf = 0.49 értékű aktív frakciókat összegyűjtjük, majd csökkentett nyomáson 2 térfogatrésznyire bepároljuk. Ehhez a koncentrátumhoz 20 térfogatrész petrolétert adunk, amikor 1,08 súlyrész nyers kristály különíthető el. A nyers kristályokat 20 térfogatrész meleg etil-acetátban oldjuk, majd a kapott oldatból lehűtése után 0,92 súlyrész P—4 antibiotikumot különítünk el. A P—4 kristályok tisztasága 94 súly%, olvadáspontja 178 — -180 °C. 4. példa 400 térfogatrész 50% metanolt tartalmazó vizes elegyben feloldunk a 3. példa szerint előállított nyers termékből 20 súlyrészt. 1000 térfogatrész Diaion HP—10 gyantát (gyártja a Mitsubishi Industries Ltd. japán cég) 3000 térfogatrész 50% metanolt tartalmazó vizes eleggyel 2,5 cm átmérőjű oszlopba töltünk, majd a tisztítandó termék oldatát az oszlopon átbocsátjuk és az oszlopot 1000 térforgatrész 60% metanolt tartalmazó vizes eleggyel mossuk. Ezután gradiens-eluálást végzünk 7500 térfogatrész 60% metanolt tartalmazó vizes elegy és 7500 térfogatrész 95% metanolt tartalmazó vizes elegy alkalmazásával. 75 térfogatrész nagyságú frakciókat szedünk, majd minden egyes frakciót a 3. példában ismertetett módon szilikagél lemezen vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatnak vetünk alá. A 182-190. aktív frakciókat összeöntjük, majd bepároljuk. A maradékhoz 500 térfogatrész vizet és 1000 térfogatrész etil-acetátot adunk, majd az így kapott keveréket választótolcsérben rázzuk. A vizes fázist ezután elválasztjuk, az etil-acetátos fázist pedig 300-300 térfogatrész vízzel kétszer mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, betöményítjük és állni hagyjuk. A P—4 anbitiotikum ekkor kiváló kristályait kiszűrjük és szárítjuk, 0,950 súlyrész terméket kapva. Ezeknek a kristályoknak a tisztasága 92 súly%, olvadáspontjuk pedig 177-179 °C. 5. példa Az 1. példában ismertetett fermentálásban L-leucin helyett leucin-metilésztert, leucin-N-metil-amidot, alfa-keto-izokapronsavat vagy leucin-hidrokloridot használva hasonló eredményeket kapunk, azaz a P—4 antibiotikum specifikus képződését észlelhetjük. 5 10 15 20 31 33 40 4. 50 5 ' 63 65 8
