179594. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heparin előállítására
3 179594 4 Egyesült Államok gyógyszerkönyve; USP-egység = az Egyesült Államok gyógyszerkönyvében használt egység hatóanyagok hatóértékének kifejezésére). Az eddigi kereskedelmi forgalomban levő heparin-készítmények heparin-minősége rendszerint 150 USP-egység/mg, néhány kevés esetben 155 USP-egység/mg. Egy USP-egység/mg alatt azt a fajlagos aktivitást értjük, amelyet az USP-vizsgálatban kapunk, amikor a konzervált birka-plazma agglutinációjának gátlását mérjük. 1 USP-egység körülbelül 1,1 nemzetközi egységnek (NE) felel meg. Mivel a kereskedelmi forgalomban lévő he parin-készítmények aktivitás-értékei a sok eljárás-javítás ellenére sem kielégítőek, az Amerikai Egyesült Államok gyógyszerkönyve például előírja, hogy a heparin-készítményeknek (bélnyálkahártyából) legalább 140 USP-egységet kell tartalmaztok. Eddig csak L. W. Kananagh és L. B. Jaques [Arzneimittelforsch. (Drug Res.) 24/12, 1942 (1974)] tudott laboratóriumban ismételt átkristályos it ássál báriumsó alakjában maximálisan 175 USP-egység pro mg aktivitású heparint izolálni. Állati belek tartósítására és víztelenítésére különösen olyan konyhasóoldatok alkalmasak, melyeknek konyhasótartalma 0,5 mól és a telítési mólmennyiség közé esik. Különösen előnyösek a 3 mól és a telítési mólmennyiség közötti konyhasótartalmú oldatok. Telítési mólmennyiség alatt azt a mólmennyiséget értjük, amelyet a vágóhíd környezeti hőmérsékletén egy telített vizes konyhasóoldat, oldott konyhasóból tartalmaz. (Egy tömény vizes konyhasóoldat körülbelül 26,4%-os). Tömény vizes konyhasóoldat keletkezik például akkor is, ha a csuromvizes állati beleket konyhasóval beszórjuk. A nyálkamentesített állati beleket általában 2 órától 3 napig kezeljük konyhasóoldatokkal, de a kezelés már többnyire 3—24 óra alatt befejeződik. A tartósított és víztelenített állati beleket a konyhasóoldatból eltávolítva olyan bél-sóslevet kapunk, amely meglepően magas heparin-tartalommal rendelkezik. Az ilyen bél-sóslevek nyersanyagként való találmány szerinti felhasználása útján ipari méretekben is csaknem színtelen, nagy tisztaságú heparint sikerült izolálni. Ezzel szemben az egyéb nyersanyagokból rendelkezésre álló nyersheparinokat mind a mai napig először költséges és nagy veszteségekkel járó eljárásokkal színteleníteni kell (3 179 566 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). így a bél-sóslé raktározható, csaknem szagtalan nyersanyag, melynek minősége hosszú tárolás alatt sem romlik. Ezáltal nincs szükség kémiai és más tartósító eljárások alkalmazására. A találmány tárgyát tehát bél-sóslevek heparin-előállításra való felhasználása képezi. E bél-sóslevekhez a nyálkamentesített állati belek konyhasóoldatokba való behelyezése útján jutottunk hozzá A találmány tárgyát képezi továbbá a tiszta heparin izolálására szolgáló, önmagában ismert eljárás. À találmány szerint tehát a nyálkamentesített állati belek konyhasóoldatba való betevése által kapott bél-sósleveket használjuk fel kiindulóanyagként. 600 liter sósléhez 1500 literes keverőműben szobahőmérsékleten, keverés közben, 1/2 óra alatt 600 liter metanolt adunk. Utána 1/2 óráig tovább keverjük, majd a keveréket 1 óráig állni hagyjuk. A zavaros felülúszót egy másik edénybe dekantáljuk és a kivált sópogácsát megtartjuk. À dekantált szuszpenziót 2 napig állni hagyjuk, majd ismét dekantáljuk, a felülúszót elöntjük és a csapadékot centrifugálással izoláljuk. Vákuumban való szárítás után 1,44 kg terméket kapunk, amely körülbelül 10 USP-egység/mg aktivitású. A termék még mintegy 45% konyhasóból áll. Az így kapott nyers heparin alikvotját, mely körülbelül 425 000 USP-egységnek, illetve 42,5 g-nak felel meg, 3 x 200 ml 2 mólos konyhasóoldattal extraháljuk, miközben mindig 1 óráig 60 °C-on keverjük. Az egyesített kivonatokat annyi vízzel hígítjuk, hogy az oldat körülbelül 0,9 mól/liter kloridiont tartalmazzon. Ekkor 200 ml klorid-formájú anioncserélőt (Lewatit CA 9249) adunk hozzá és 1 óráig keverjük. Utána a keveréket leszívatjuk és a maradékot körülbelül 200 ml 0,9 mólos konyhasóoldattal átmossuk. Ezután az ioncserélőt 5 óráig 2 mólos konyhasóoldattal 40 °C-on keverjük, majd leszívatjuk és 2 mólos konyhasóoldattal átmossuk. Az eluáló oldatot a mosóoldattal egyesítjük és 1,5-szeres térfogatú metanollal kicsapjuk. A csapadékot lecentrifugáljuk és először körülbelül 50 ml víz-metanol (1 : 1,5 térfogatrész) eleggyel, majd mintegy 50 ml metanollal átmossuk és szárítjuk. 198 g nátrium-heparinátot kapunk, aktivitása 195 USP-egység/mg. A fent leírt módon előállított, körülbelül 200 USP-egység/mg aktivitású nátrium-heparinát 15,5 g-ját 200 ml 2 mólos konyhasóoldatban oldjuk. Az oldatot nuecs-szűrőn leszívatjuk és a maradékot először 30 ml 2 mólos konyhasóoldattal, majd körülbelül 250 ml só mentesített vízzel mossuk. Az egyesített oldatokat sómentesített vízzel 0,9-es klorid-molaritásra állítjuk be. Ezután a fentiek szerint a tisztítást 1 liter Lewatit CA 9249 ioncserélővel megismételjük. Az egyesített elúciós- és mosóoldatokat a fentiek szerint feldolgozzuk. A csapadék mosása és szárítása után 1 i ,2 g nátrium-heparinátot kapunk, melynek aktivitása 251 USP-egység/mg. 1. példa 2. példa A 754 885 számú brit szabadalmi leírás szerint 3 liter sóslevet keverés közben ecetsavval ^körülbelül 50 ml) pH 3,1-3,2-ig megsavanyítunk. Néhány óra múlva dekantáljuk és a maradékot centrifugáljuk. A csapadékot eldobjuk, az egyesített oldatokat nátrium-hidroxid-oldattal semlegesítjük. A keverékhez keverés közben lassan azonos térfogatú metanolt adunk. 45 perc múlva a kivált konyhasóról a felülúszót dekantáljuk. Ezt a szuszpenziót néhány óráig állni hagyjuk, a felülúszót dekantáljuk és a maradékot centrifugáljuk. A csapadékot vákuumban szárítjuk. 3,43 g terméket kapunk 21 USP-egység/mg aktivitással. A kapott nyersheparin 20,2 g-os alikvotját (körülbelül 425 000 USP-egység) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
