179561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neoviridogrisein-antibiotikumok előállítására
179561 része. A fermentáció végén a micéliumokat és a szilárd anyagokat szűréssel eltávolítjuk. A kapott fermentlé-szűrlet pH-ját 6,0-ra állítjuk be és 4 x 2 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos kivonatokat egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és csökkentett nyomáson szárazra párolva 700 mg nyers neoviridogriseineket és griseoviridint kapunk. A neoviridogriseinekből és griseoviridinből álló port kevés metanolban oldva Sephadex LH—20 oszlopra (3 x 50 cm) visszük fel. Metanol-eluenssel 10 ml-es frakciókat szedünk. A neoviridogriseineket a 22—29. számú frakciók tartalmazzák. E frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk és szilikagéioszlopkromatográfiával (Silicar CC-% Special, Mallinckrodt Chemical Works, 1,5 x 20 cm) tovább tisztítjuk. Eluensként kloroform/metanol (30 : 1) elegyet használunk. 5 grammos frakciókat gyűjtve az 5—12. frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson szárazra párolva neoviridogriseinekből álló 25 mg fehér port kapunk. E porban a neoviridogrisein I, II és III és a viridogrisein megoszlása a következő: 19 Neoviridogrisein I 15% II 20% III 20% Viridogrisein 45% TLC-elemzéssel azt találtuk, hogy a griseoviridint a fenti Sephadex LH-20 oszlop 30-34. frakciója tartalmazza. Ezeket az aktív frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és meleg metanolból kristályosítva 30 mg tű alakú griseoviridin-kristályt kapunk. E kristályokat rétegkromatográfia és más fizikokémiai meghatározások útján griseoviridinként azonosítjuk. 3. példa Az 1. példában leírt fermentálást hajtjuk végre 96 órán át, azzal a különbséggel, hogy a fermentációhoz használt táptalaj 0,5% szójabablisztből, 0,5% Pharmamediából, 0,5% zablisztből, 0,5% száraz élesztőből, 0,5% cukorrépa-melaszból és 0,1% DL-alfa-amino-n-vajsavból áll (pH 6,5). 13 lombik fermentlevét egyesítjük és leszűrjük. A szűrletet 2 x 300 ml n-butanollal extraháljuk. A kivonatokból a n-butanolt eltávolítva körülbelül 70 mg, neoviridogriseinekből és griseoviridinből álló nyers por marad vissza. E nyers port szilikagélrétegkromatográfiával, majd bioautográfiával elemezzük, tesztmikroorganizmusként Sarcina luteát használva. (A vizsgálathoz használt TLC-lemez: Silicagel 60 F-254 Fertigplatten, E. Merck, Darmstadt). A kapott Rf-értékek és az oldószerrendszerek a következők: Kloroform/metanol 20 : 1 30 :1 40:1 Neoviridogrisein I Rf =0,60 0,39 0,20 II 0,56 0,32 0,16 III 0,50 0,19 0,13 Viridogrisein 0,43 0,18 0,10 Griseoviridin 0,05 0,02 0,00 4. példa 0,3% marhaszív-kivonatot, 0,5% triptont (Difco), 0,1% glükózt, 2,4% oldható keményítőt, 0,5% élesztő tőkivonatot, 0,4% kalcium-karbonátot és 0,5% szójabablisztet tartalmazó 50 ml előtenyészet-táptalajt (pH 7,0) 250 ml-es Erlenmeyer lombikba töltünk és 120°C-on 15 percig autoklávozzuk. Ferde agaron növő Streptomyces sp. P 8648 spórákkal oltjuk be a fenti táptalajt és rázatás közben 25 °C-on 3 napig tenyésztve állítjuk elő az előtenyészetet. A fermentációs táptalaj 0,5% oldható keményítőt, 2,0% glükózt, 1,0% Pharmamediát, 0,5% zablisztet, 0,5% kukoricalekvárt, 0,05% dikálium-foszfátot és 0,05% magnézium-szulfátot tartalmaz (pH 6,5). E fermentációs táptalajból 50 ml-t 250 ml-es kúpos palackba helyezünk és 120°C-on 15 percig autoklávozzuk. A fermentációs palackot beoltjuk a fent leírt előtenyészettel és 25 °C-on forgó rázógépben inkubáljuk. Beoltás után 24 vagy 48 óra múlva kazaminsav sterilezett oldatát (Difco) vagy prolint (pH 7,0) adunk a tenyészethez 0,4% végkoncentrációig és a fermentációt folytatjuk. Beoltás után 4 nap múlva a fermentlevet leszűrjük és a szűrletet kétszer azonos térfogatú etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos kivonatokat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepárolva száraz port kapunk. E nyers port felvesszük etil-acetátban és az oldat egy alikvotját mennyiségileg szilikagél TLC-lemezre cseppentjük fel. A TLC-lemezt még egyszer kifejlesztjük a fenti oldószereleggyel. A neoviridogrisein-komponenseket UV-fényben (3650 Â) lokalizáljuk, a lemezről lekaparjuk és ismert térfogatú metanolban szuszpendáljuk, A szilikagélt dekantálással eltávolítjuk és a kivonatban levő antibiotikumok mennyiségét UV-spektroszkópia segítségével határozzuk meg, tudva, hogy az epszilon-érték 305 nm-nél 8 000. Az UV-elemzés eredménye a következő: Hozzáadott aminosav 20 Semmi minsav Neoviridogrisein I 2% 2% 2% II 9% 40% 60% III 4% 3% 3% Viridogrisein 85% 55% 35% 5. példa Fermentorban körülbelül 10 liter 23 órás előtenyészetet készítünk a 2. példában leírt körülmények között. A fermentációs táptalaj (600 liter) 0,5% szójabablisztet, 0,5% Pharmamediát, 0,5% zablisztet, 0,5% száraz élesztőt, 0,5% cukorrépa-melaszt és 0,1% DL-alfa-amino-n-vajsavat tartalmaz (pH-ját autoklávozás előtt 6,5-re állítjuk be) és 120°C-on 15 percig 1400 literes rozsdamentes acél-fermentorban gőzzel sterilezzük, majd lehűtjük 28 °C-ra. E fermentorhoz hozzáadjuk a fent leírt előtenyészetet (10 liter) és 28 °C- on 75 óráig mesterséges levegőztetés és percenkénti 180 fordulattal való keverés (kettős terelőlapáttal, a kötsugár a fermentor átmérőjének 1/4-e) közben tenyésztjük, a steril levegőt a fermentor alján levő permetezőn át tápláljuk be 300 liter per perc ütemben. A fermentálást befejezve a fermentlevet szűrőprésen átszűrjük. A szűrletet 2 x 150 liter n-butanollal extraháljuk. A n-butanolos kivonatokat egyesítjük, kis 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
