179561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neoviridogrisein-antibiotikumok előállítására
21 179561 éifogatú telített nátrium-klorid-oldattal mossuk és forgó bepárlóban 2 liter térfogatra bepároljuk. Ekkor 20 g szilikagélt (WAKOGEL G-100, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) adunk hozzá és a forgó bepárlóban a bepárlást folytatva az anyagot szárazra pároljuk. A kapott antibiotikum — szilikagél keveréket kevés kloroformban szuszpendálva szilikagél-oszlop WAKOGEL C—100, 6,5 x 75 cm) tetejére visszük fel. Az aktív antibiotikumokat szakaszosan eluáljuk először 7 liter kloroformmal, majd 10 liter kloroform/metanol (50 : 1) eleggyel, végül metanollal. A 16—19. számú, neoviridogriseineket tartalmazó frakciókat (300 g per frakció) — melyek Sarcina luteán bioaktívnak bizonyultak — összegyűjtjük és csökkentett nyomáson szárazra párolva neoviridogriseinekből álló nyers port kapunk. E nyers port kevés metanolban oldjuk és Sephadex LH—20 oszlopon (7 x 45 cm) bocsátjuk át, minden frakciót (100 g) metanollal eluálva. A 6—15. számú frakciókból az oldószer lepárlása után mintegy 15 g, neoviridogrisein-keverékből álló nyers port kapunk. A fent leírt szilikagél-oszlop 50—60. számú frakciója griseoviridint tartalmaz. Sephadex LH-20 oszlopon (7 x 45 cm) a neoviridogriseinkeverékkel azonos módon megtisztítva 4 g nyers griseoviridint kapunk. 6. példa Végső tisztítás céljából preparatív rétegkromatográfiát végzünk szilikagél TLC-leniezeken. Az 5. példában előállított nyers neoviridogrisein-keverék 1 g-ját feloldjuk 2 ml etil-acetátban és sáv-formában 10 szilikagél-lemezre visszük fel (Silica Gel 60 F—254 Fertigplatten). A lemezeket először kloroform/metanol (50 :1) eleggyel fejlesztjük ki. Miután az oldószert levegőn elpárologtattuk, a lemezeket másodszor is kifejlesztjük kloroform/metanol (25 : 1) oldószerelegygyel. A neoviridogrisein I, II, III és a viridogrisein sávjait UV-fényben (3650 Â, BLAK—RAY UVL—22, Ultra-Violet Products, Inc.) megjelöljük és a lemezekről lekaparjuk. A neoviridogrisein-komponenseket kevés metanollal eluáljuk és szárazra pároljuk. A neoviridogrisein-komponensek kinyerése tiszta állapotban a következő: Neoviridogrisein I: 16,7 mg (kevésbé tiszta, olajos) II: 11,1 mg (fehér por) III: 15,2 mg (fehér por) Viridogrisein 30,0 mg (fehér por) A neoviridogriseineknek körülbelü 5 mg-jat 6n sósavoldattal 110 °C-on 36 óráig lefori isztotl csőben hidrolizáljuk és a mintákon rétegkroinatogránát, pa pírkromatográfiát, nagyfeszültségű papírelektroforé zist és auto-aminosav-analízist végzünk. A komponensekben a következő alkotórészek találhatók: Neoviridogrisein 1: 3-hidroxi-pikolinsav treonin leucin prolin szarkozin beta,N-dimetil-leucin alfa-amino-n-vajsav fenil-szarkozin Neoviridogrisein II: 3-hidroxi-pikolinsav treonin leucin prolin szarkozin beta,N-dimetil-leucin alanin fenil-szarkozin Neoviridogrisein III: 3-hidroxi-pikolinsav treonin leucin hidroxi-prolin szarkozin beta,N-dimetil-leucin aifa-amino-n-vajsav fenil-szarkozin Viridogrisein: 3-hidroxi-pikolinsav treonin leucin hidroxi-prolin szarkozin beta ,N-dimetil-leucin alanin fenil-szarkozin A neoviridogrisein IV-nek a viridogriseinnel való azonosságát még infravörös-, ultraibolya, mágneses magrezonancia- és tömegspektrometriával, hidrolizátum-elemzéssel és antimikrobiális spektrometriával is megerősítettük. Másrészt az 5. példában kapott griseoviridin-készítményt meleg metanolból kristályosítva tűkristályokat kapunk. E tűkristályok egy részét infravörös, ultraibolya-, mágneses magrezonancia- és tömegspektrometria, rétegkromatográfia, elemi analízis és más fizikokémiai vizsgálatok segítségével hasonlítjuk össze és azonosítjuk a standard griseoviridin-mintával.- 22 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás neoviridogrisein I, neoviridogrisein II és neoviridogrisein III depszipeptid antibiotikumok és adott esetben viridogrisein és griseoviridin előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces sp. P8648 (FERM—P3562) törzset aerob körülmények között, 18-37 °C közötti hőmérsékleten asszimilálható szénforrásokat, asszimilálható nitrogénforrásokat és esszenciális ásványi sókat, adott esetben aminosavakat tartalmazó, körülbelül 6-9 pH-jú vizes táptalajon addig tenyésztünk, amíg a táptalaj antibiotikus akti vitása maximális lesz, majd a fermentáció termékeit a táptalajból kinyerjük és — kívánt esetben — elválasztjuk a neoviridogrisein I, a neoviridogrisein II és a neoviridogrisein III antibiotikumokat, és adott esetben a viridogriseint és griseoviridint is kinyerjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt alfa-amino-n-vajsav és/vagy alfa-amino-n-vajsavat tartalmazó természetes for'ások jelenlétében hajtjuk végre. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fermentációt prolin és/vagy prolint tartalmazó természetes forrás jelenlétében hajtjuk végre. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
