179561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neoviridogrisein-antibiotikumok előállítására
7 í 8 Mint a fenti táblázatból látható, világos különbségeket állapítottunk meg a Streptomyces griseuviridus NRRL 2427 és a találmány szerinti Streptomyces-species között a morfológiai és tenyésztési jellemzők, valamint a szénforráshasznosítási kép alapján. Ezenfelül ha mindkettőt azonos körülmények között tenyésztjük, a találmány szerinti mikroorganizmus neoviridogrisein 1, II és III, valamint viridogrisein (neoviridogrisein IV) és griseoviridin létrehozá sara képes, míg a Streptomyces griseoviridus NRR7 2427 csak viridogriseint és griseoviridint képez, de nem képes neoviridogrisein I, II és III létrehozására. A fenti eredményekből arra következtettünk, hogy a találmányban használt mikroorganizmus egy új Streptomyces-species és elneveztük Streptomyces sp. P 8648-nak. E mikroorganizmus típus-tenyészetét a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology deponálta, FERM-P 3562 deponálási számmal. A szakember előtt érthető módon a találmány nem korlátozódik a Fermentation Research Institute által FERM—P 3562 számon deponált specifikus mikroorganizmusra, hanem kiterjed a fenti mikroorganizmusból származó mindazon spontán és mesterséges mutánsra, amelyek a neoviridogrisein I, II és III nevű új antibiotikumok termelésére képesek. A találmány szerinti új antibiotikumokat úgy állítjuk elő, hogy a Streptomyces sp. P8648 törzset alkalmas táptalajba beoltjuk és aerob körülmények között tenyésztjük 18—37 °C-on 24—14 napig, majd a felhalmozódott antibiotikumokat kinyerjük a fermentlébő) és szokványos módszerekkel megtisztítjuk. A találmány szerinti eljárás előnyben részesített kivitelezését részletesebben az alábbiakban közöljük: A találmány szerinti mikroorganizmus fermentálásához a Streptomyces-speciesek minden jól ismert táptalaja alkalmazható. A táptalaj előnyös szénforrása például glükóz, glicerin, keményítő, dextrin, zabliszt, melasz, zsír, olaj és hasonlók. Alkalmas nitrogénforrás a szójababliszt, gyapotmagliszt, húskivonat, pepton, száraz élesztő, kukoricalekvár, élesztőkivonat, kazein és hidrolizátuma, szervetlen sók, mint ammónium-szulfát és ammónium-nitrát. Kívánt esetben kis mennyiségben növekedési faktorok adhatók a táptalajhoz. Ezek közé tartoznak vitaminok, aminosavak, szerves és szervetlen sók, mint kalcium-karbonát, nátrium-klorid, kálium-kiorid, nátrium-foszfát, kálium-foszfát és magnézium-szulfát. A találmány szerinti új antibiotikumokat szokásos edényekben, mint rázatott lombikban, üvegfermentorban vagy fémfermentorban termelhetjük, de gazdaságossági szempontból üzemi szinten a mesterséges levegőztetés közben végzett süllyesztett tenyésztés a legelőnyösebb. A fermentációt előnyösen aerob körülmények között, 25—35 °C hőmérséklettartományban hajtjuk végre. Ha rázatott lombikot vagy fermentort használunk, a neoviridogriseinek képződése általában 2-10 nap alatt maximális. A fermentáció során a pH-érték a fiziológiás határokon túl változhat, függően a használt táptalaj fajtájától. Kívánatosabb a pH-t 6-9 közé beállítani és ebben a tartományban tartani a fermentáció folyamán. Állalá ban a táptalaj pH-ját 6,5-8,5-re állítjuk be beoltái előtt. Mint említettük, a találmány szerinti mikroorganizmus a neoviridogrisein I, II, III és IV és griseoviridin keverékét termeli. Megváltoztathatjuk a neoviridogriseinek összetételét a fermentlében a táptalaj szén- és nitrogénforrásainak alkalmas kombinációja útján, szabad aminosav vagy szerves sav hozzáadása nélkül. Ipari termelés szempontjából azonban előnyösebb, ha a fermentlé neoviridogrisein I, II és/vagy 111 tartalmát megfelelő szabad aminosav(ak) hozzáadása útján állítjuk be a fermentáció folyamán, függően a körülményektől és a kívánalomtól. A neoviridogriseinek összetétele a fermentlében természetesen változtatható a találmány szerinti Streptomyces-speciesből származó spontán vagy mesterséges mutánsok megfelelő megválasztásával, a fermentáció körülményeinek, mint a hőmérsékletnek, pH-nak és a levegőztetésnek a szabályozásával, és/vagy fiziológiailag aktív anyagoknak, mint enzim-gátlóknak vagy enzimműködést fokozó anyagoknak a táptalajhoz való hozzáadásával. Meghatározott neoviridogrisein komponensek szelektív előállításának előnyös módszerét jelenti az az eljárás, amikor a fermentáció alatt megfelelő aminosava(ka)t, alfa-amino-n-vajsavat és/vagy prolim adunk a táptalajhoz. Közelebbről, a fermentáció folyamán hozzáadott prolin növeli a neoviridogrisein I és II százalékát a neoviridogrisein I, II, III és IV összmennyiségén belül, a neoviridogrisein I és II mikróbaellenes aktivitása felülmúlja a neoviridogrisein III és IV aktivitását. Ugyanez vonatkozik az alfa-amino-n-vajsav alkalmazására. A neoviridogrisein 1 és III mennyisége szelektíven növelhető olyan módon, hogy beoltás előtt vagy fermentáció közben alfa-amino-n-vajsavat adunk a táptalajhoz. Mivel a találmány szerinti mikroorganizmus szaporodása folyamán proteázt termel, az említett megfelelő amínosav(ak)at tartalmazó fehérje-jellegű anyagok is alkalmazhatók a szabad aminosav(ak) helyett. Például a prolin kazeinnel, vagy ennek savas hidrolízissel előállított megfelelő hidrolizátumaival, például kazaminsavakka! helyettesíthető. A neoviridogrisein I, II és III és a viridogrisein nevű új antibiotikumok a depszipeptid antibiotikumok fizíkokémiai tulajdonságain alapuló szokványos módszerekkel izolálhatok a fermentléből. Szükség esetén a neoviridogriseinek griseoviridinnel együtt neoviridogrisein — griseoviridin keverék formájában nyerhetők ki a tenyészléből. Ha takarmányadalékként vagy állati gyógyszerként való felhasználásra állítjuk elő őket, gazdaságossági szempontból előnyösebb a neoviridogriseinek és a griseoviridin nyers keverékét használni. A neoviridogriseineket és a griseoviridint vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel vonjuk ki a fermentléből. Például etil-acetát, butil-acetát, n-butanol, metilén-klorid, kloroform és hasonlók alkalmasak a neoviridogriseinek és a griseoviridin együttes kinyerésére. Ha a neoviridogriseineket griseoviridin nélkül szelektíven kívánjuk kivonni, előnyben részesített szerves oldószer a metil-izobutil-keton, benzol, toluol és más aromás szénhidrogének. Mivel a micélium lényegében nem tartalmaz neoviridogriseineket és a sejtekből kivonható zsír gyakran zavarja a későbbi tisztítási műveleteket, előnyösebben járunk el, ha a fenti antibioti5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
