179561. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neoviridogrisein-antibiotikumok előállítására
9 179561 10 kumokat valamely szerves oldószerrel a leszűrt vagy lecentrifugált tenyészléből és mosófolyadékokból extraháljuk. A neoviridogriseinek és/vagy a griseoviridin oldó- 5 szeres kivonata különböző módszerekkel tovább izolálható és tisztítható. Például adszorpciós és elúciós eljárásokkal aktív szénnel, Amberlite XAD—4 és 7 (Rohm and Haas Co.) segítségével, ioncserélő gyantákkal, mint Amberlite IR—120 (Rohm and Haas, Co.) ! 0 és Dowex 50W-X2 (Dow Chemical Co.) útján, gélszűréssel Sephadex LH—20 (Pharmacia Fine Chemicals AB) és hasonlók segítségével, adszorpciós kromatográfiával alumínium-oxid- vagy szilikagél-oszlopon, stb. A fenti módszerek előnyösen kombinál- 15 hatók izolálás és tisztítás céljából. Ezenfelül frakcionáló megosztás alkalmas oldószer-réndszerrel igen alkalmas a fenti célokra. A neoviridogrisein I, II és III, valamint a viridögrisein amorf fehér szilárd anyagok és oldódnak méta- 20 nolban, etanolban, dioxiánban, etil-acetátban, butil-acetátban, acetonban, metil-etil-ketonban, metil-izobutil-ketonban, benzolban, toluolban, metilén-kloridban, kloroformban, tetraklór-metánban, N,N-dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, alig oldódnak 25 vízben és etil-éterben, és gyakorlatilag oldhatatlanok petroléterben és hexánban. Vizes oldat formájában legalább 1 hónapig stabilak 25—37 °C-on, és 30 percig 60 °C-on pH 2—9 között. Az antibiotikumok olvadáspontját Kofler-készü- 30 lékben határoztuk meg és a következő eredményeket kaptuk: Neoviridogrisein II (KBr-tabletta): 3320, 2950, 2920, 2820, 2800, 1745, 1670 (váll), 1630, 1600 (váll), 1575, 1515, 1460 (váll), 1445, 1405, 1390, 1365, 1330 (váll), 1295, 1275, 1240, 1200, 1195, 1160, 1130, 1095 és 1065 cm"1. Neoviridogrisein III (KBr-tabletta): 3335, 2960, 2940, 2870, 1750, 1670 (váll), 1660 (váll), 1635, 1590 (váll), 1515, 1450, 1405, 1390 (váll), 1370, 1340 (váll), 1300, 1245, 1200, 1160 (váll), 1130, 1100 és 1065 cm-1. Az alább ismertetett rétegkromatográfiás (TLC) rendszerekben a neoviridogrisein I, II, III és a griseoviridin Rf-értékei a következők: 1. TLC-lemez: Silicagel 60F—254 lemez (Silicagel Vertigplatten, E. Merck, Darmstadt) oldószer: benzol/metanol = 5/1 neoviridogrisein I: Rf = 0,66 II: 0,62 III: 0,59 viridogrisein: 0,55 griseoviridin: 0,20 2. TLC-lemez: azonos a fent leírttal oldószer: kloroform/metanol = 30/1 neoviridogrisein I: Rf = 0,39 II: 0,32 III: 0,19 viridogrisein: 0,18 griseoviridin: 0,02 Neoviridogrisein I II III Viridogrisein: nem határoztuk meg 93 ° C 35 115 °C 140 °C A neoviridogrisein I, II, III és a viridogrisein ultraibolya abszorpciós spektrumait az 1—8. ábra mutatja, 40 az 1—4. ábra a fenti anyagok metanolban és az 5-8. ábra 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatban felvett spektruma. A neoviridogriseinek E}^m értéke a maximumokon a következő: Neutrális metanolban Neoviridogrisein I: II: III: Viridogrisein: 305 nm (65) 305 nm (88) 305 nm (90) 305 nm (90) 0,1 n nátrium-hidroxid-oldat/metanol elegyben Neoviridogrisein I: 340nm(70) II: 340nm(84) III : 340 nm (96) Viridogrisein: 340 nm (96) 50 55 A neoviridogrisein I, II, III és a viridogrisein infravörös (IR) spektrumát KBr-tableriában a 9—12 ábra, mutatja. A jellemző csúcsok és vállak a következő hullámszámokon jelentkeznek : 60 Neoviridogrisein I (KBr-tabletta): 3370, 2910, 2850, 1735, 1670 (váll), 1635, 1590 (váll), 1515, 1460 (váll), 1445, 1405, 1375, 1290, 1280, 1250 (váll), 1200, 1190,1160,1100 és 1080 cm-1. 65 Az aminosav-alkotórészek vizsgálata céljából mindegyik neoviridogrisein-komponenst 6n sósavoldatban éjszakán át 110°C-on hidrolizáljuk és a hidrolizátumot szárazra pároljuk. Ismételt bepárlásokkal a sósav nyomait is eltávolítjuk, és az aminosavakat a hidrolizátumban rétegkromatográfiával (Eastman Chromagram 13254 cellulóz lemez fluroeszcens indikátorral, Eastman Kodak Co., oldószerrendszer: n-butanol/ecetsav/víz = 4:1:1} nagyfeszültségű papír-elektroforézissel (Toyo Filter paper No. 51A, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., puffer-rendszer: hangyasav/ecetsav/víz= 25 : 75 :900, pH = 1,8, 60 V/cm 0 °C-on 30 percig) és automatikus aminosav-analizátorral (Hitachi auto-amino acid analyzer KLA—5, Hitachi, Ltd.) határozzuk meg. A következő aminosavakat matatjuk ki: Neoviridogrisein I: Neoviridogrisein II: Neoviridogrisein ti: treonin leucin prolin alfa-amino-n-vajsav szarkozin fenil-szarkozin beta ,N -dimetil-leucin treonin leucin prolin alanin szarkozin fenil-szarkozin beta, N-dimetil-leucin \ 5
