179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
7 179542 8 konjugáttal érintkezne. A folyadékmintával érintkeztetett specifikus kötőpartner mennyisége rendszerint fölöslegben van ahhoz a mennyiséghez képest, amely képes a folyadékmintában feltételezhetően jelenlevő ligandumok teljes mennyiségével specifikus kötési reakcióba lépni azon idő alatt, amikor a folyadékminta és a specifikus kötőpartner egymással érintkezésben annak a folyadékminta és a konjugát egymással való érintkeztetését megelőzően. Továbbá akonjugátba vitt ligandumnak vagy specifikus kötési analógjainak a mennyisége rendszerint fölöslegben van ahhoz a mennyiséghez képest, amely képes a specifikus kötőpartner kötésbe nem lépett mennyiségével reagálni azalatt az idő alatt, amikor a folyadékminta és a konjugát egymással érintkezésben vannak a konjugátban kötött reaktáns aktivitásában bekövetkező bárminemű változás észlelésének befejezését megelőzően. Az előre meghatározott követési reakció egyik komponensét alkotó, konjugátban kötött reaktáns aktivitásában bekövetkező bárminemű változás meghatározását, illetve észlelését előnyösen úgy foganatosítjuk, hogy a specifikus kötési reakcióelegyet legalább egy olyan anyaggal érintkeztetjük, amely a konjugátba vitt reaktánssal reakcióba lép, vagyis létrehozza a követési reakciót, és meghatározzuk a specifikus kötési reakció hatását a követési reakció valamelyik jellemzőjére. Heterogén kimutatási sémák vagy rendszerek Egy reaktáns jelzőanyagként való használatát alkalmazhatjuk a hagyományos heterogén kimutatási technikák esetében is, ahol a jelzett komponenst tartalmazó kötött fázist és szabad fázist egymástól elválasztjuk, majd a jelzőanyag mennyiségét valamelyik fázisban meghatározzuk. Egy ilyen heterogén kimutatási technika megvalósításához alkalmazható reagenseszköz sokféle különböző formájú, illetve összetételű lehet. Általában azonban egy ilyen eszköz három alapvető komponenst tartalmaz, éspedig (1) a kimutatandó ligandumot, (2) a ligandum egy specifikus kötőpartnerét és (3) egy jelzett komponenst, amely rendszerint (a) a ligandum, (b) a ligandum specifikus kötési analógja vagy (c) a specifikus kötőpartner jelzett formája. A specifikus kötési reakcióban részt vevő reakciópartnereket egyidejűleg vagy adagolások sorozatában kombináljuk egymással és alkalmasan megválasztott inkubálási periódust vagy periódusokat hasznosítunk, amikor is a jelzett komponens úgy kötődik megfelelő kötőpartneréhez, hogy a kötés mértéke, azaz egy kötőpartnerhez kötött jelzett komponens mennyisége a kötetlen jelzett komponens mennyiségéhez képest a jelenlevő ligandum mennyiségének függvénye. Ä találmány szerinti eljárásban alkalmazható különböző kötési reakciósémákat ismertetjük röviden az alábbiakban. Míg a hagyományos heterogén kimutatási technikák, például a radioimmunológiai vagy enzimatikus immunológiai meghatározások esetében a jelzett konjugátban a jelzési mód, például a radioaktivitás vagy az enzimatikus aktivitás lényegében azonos a konjugát szabad és kötött formáiban, addig a találmány szerinti eljárás esetében a jelzőanyagként használt reaktáns aktivitását bizonyos esetekben befő! ásolja az a tény, hogy jelzett konjugát formájában kötve van. Ilyen helyzetben a követési reakciónak viszonylag egyenletes jellege van abban az esetben, ha a vizsgálandó folyadékminta nem tartalmaz vagy csak nem szignifikáns mennyiségben tartalmaz ligandumot. Ha a vizsgálandó folyadékminta tartalmaz ligandumot, akkor - miként a homogén kimutatási technika korábbi tárgyalásánál már említettük — a követési reakció egyik jellemzője vagy tulajdonsága meg fog változni. Az alábbi diagramokban az alábbi szimbólumokat fogjuk használni: Szimbólum Definíció L meghatározandó ligandum (antigén — illetve haptén) © ligandum specifikus kötési analógja B a ligandum specifikus kötőpartnere x jelzőanyag, azaz a reaktáns |- oldhatatlan fázis-------» inkubálási periódus, amelyet alkalmas szeparálás követ (Üml korlátozott, vagyis az a komponens, amellyel való kötésért a többi komponens „versenyezik”, kisebb mennyiségben van jelen ahhoz a mennyiséghez képest, amely képes adott reakciókörülmények között, adott inkubálási idő alatt a jelenlevő összes kötési helyhez kapcsolódni (exc) fölösleg, vagyis az a komponens nagyobb mennyiségben van jelen ahhoz a mennyiséghez képest, amely képes adott reakciókörülmények között, adott inkubálási idő alatt a jelenlevő összes kötési helyhez kapcsolódni 1. Kompetitiv kötési módszeren alapuló heterogén kimutatási technika a) L +(px + B(lim)----->• + inszolubilizálószer B vagy(px számára Ez a klasszikus kompetitiv kötési módszer. Az ilyen inszolubilizálószerekre példaként megemlíthetjük a specifikus kicsapott antitesteket, specifikus inszolubilizált antitesteket és - ha B vagy ©x fehérje jellegű anyag - a fehérjéket kicsapó anyagokat, például az ammónium-szulfátot vagy — ha B vagy Lx kisméretű, adszorbeálható molekula — a dextránnal bevont aktívszenet. Hasonló rendszerek megismerhetők például a Biochem. J;, 88,137 (1963) irodalmi helyről és a 3 839 153 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásból. b) L + (L^ + I — B(lim)-----» Ezt a módszert szokásosan szilárdfázisú technikának nevezik. Azonos típusú radioimmunológiai és enzimatikus immunológiai vizsgálatokat, illetve vizsgálati módszereket ismertetnek többek között a 3 505 019, 3 555 143, 3 646 346 és 3 654 090 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
