179542. lajstromszámú szabadalom • Specifikus kötésen alapuló kimutatási módszer és kompozíció antigének és haptének kimutatására
9 179542 10 c) L + Bx + | — L(lim)-------► Ezt a módszert a 3 654 090 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik d) L + I - L + Bxi (lim)---> Ezt a módszert a 3 850 752 számú amerikai egye sült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetik. 2. Fokozatos telítésen alapuló heterogén kimutatási technika. a) L + B(exc)-------+d)x (exc)--------» + inszol ubilizál ószer B vagy L x számára A fokozatos telítéses technika esetében B kötési helyei közül az első inkubálási periódus után kötetlenül maradtak egy része vagy teljes mennyisége a jelzett komponens által lesz kötve. b) L + l-B(exc)------+ + (^(exc)------* Azonos típusú radioimmunológiai és enzimatikus immunológiai vizsgálati módszereket a J. Immunoi., 209, 129 (1972) irodalmi helyen és a 3 720 760 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek. c) L + B^exc)------» +1 -(D (exc)------* 3. „Szendvics” jellegű heterogén kimutatási technika. L + I - B(exc)-------> Bx(exc)-------> Ennek a technikának az esetében az inszolubilizált kötőpartnerekhez kötött ligandum-molekulák egy része vagy teljes mennyisége a jelzett komponenshez van kötve (lásd: 3 720 760 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). 4. Szilárdfázisú hígításos heterogén kimutatási technika. L + (E)x 4- - (nem specifikus)------> + + B(lim)------> Ennek a technikának az esetében a ligandumot és a jelzett komponenst egy nem specifikus kötőanyaghoz (oldhatatlan fázishoz) kötjük először, ezután pedig a nem specifikus kötőanyagról arányos mennyiségek válnak le, ha olyan kötőpartnerrel érintkeztetjük a rendszert, amelynek nagyobb a ligandummal és a jelzett komponenssel szemben mutatott affinitása, mint a nem specifikus kötőanyagé. Ennek a technikának a leginkább hasznosítható formája az, amikor nem specifikus kötőanyagból álló oszlopot használnak, mint például a 3 659 104 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás esetében. Ezt a technikát akkor lehet használni, amikor a ligandum a mintában endogén kötőanyagokhoz van kötve, amelyek - hacsak el nem távolítjuk őket - gátolják a kompetitiv kötési reakciót. Ha viszont egy nem specifikus kötőanyaghoz kötjük, akkor az endogén kötőanyagok eltávolíthatók megfelelő kimosási technikával. A fenti hagyományos heterogén kimutatási rendszerek jellemzőinek további tárgyalása, éspedig a kimutatási technikák részletesebb leírása és az alternatív szeparálási módszerek bővebb ismertetése megtalálható Odell és Daughaday korábban már említett könyvében. Követési reakciók, illetve követési reakciórendszerek A konjugátban kötött reaktánssal követési reakcióba lépő alkalmas reakciókomponensek érintkezésbe kerülhetnek 1. homogén kimutatási technikát követve a specifikus kötési reakcióeleggyel, vagy 2. heterogén kimutatási technikát követve a szeparált szabad fázissal vagy kötött fázissal egyedül vagy bármilyen kombinációban a specifikus kötési reakció kezdetét megelőzően, azzal együtt vagy azt követően. Miután a specifikus kötési reakció megkezdődött, a reakcióelegyet — amely a követési reakcióhoz szükséges komponensek valamelyikét vagy összes ilyen komponenst tartalmazhatja — rendszerint előre meghatározott időn át inkubáljuk, mielőtt a konjugátban kötött reaktáns aktivitásában (homogén technika) vagy a szeparált fázisokban mérhető reaktánsaktivitás nagyságában (heterogén technika) bárminemű változást észlelnénk. Az inkubálási periódus után a követési reakcióhoz szükséges és a reakcióelegyben még kellő mennyiségben jelen nem levő komponenst a reakcióelegyhez hozzáadjuk és a követési reakciót megfigyeljük annak érdekében, hogy a vizsgált folyadékmintában levő ligandum jelenlétét vagy akár mennyiségét megállapítsuk. A követési reakció egyik előnyös formája az előnyösen enzimkatalizált lumineszcens, vagyis fényt kibocsátó reakciórendszer, így például a biolumineszcencia vagy kemilumineszcencia jelenségét mutató valamelyik reakció. A konjugátban kötött reaktáns a fényt kibocsátó reakcióban vagy pedig egy olyan reakcióban részt vevő reaktáns lehet, amely megelőz egy enzimatikus vagy nem-enzimatikus, fénykibocsátással együttjáró reakciót. A reaktáns aktivitásában bekövetkező bárminemű változás a fénykibocsátás sebességében vagy pedig a képződő fény összmennyiségében, csúcsintenzitásában vagy jellegében okoz változást. Fényt kibocsátó reakciórendszerekre példákat az alábbi A. táblázatban adunk, amely táblázatban az alábbi rövidítéseket használjuk: ATP: adenozin-trifoszfát, AMF = adenozin-monofoszfát, NAD = nikotinamid-adenin-dinukleotid, NADH = redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid, FMN = flavin-mononukleotid, FMNH2 = redukált flavin-mononukleotid, és hr1 elektromágneses sugárzás, rendszerint az infravörös, látható vagy ibolyántúli spektrumtartományban, lumincl = 5-amino-2,3-dihidro-l,4-ftálazindion, izo-luminol = 6-amino-2,3-dihidro-l,4-ftálazindion, umbelliferon = 7-hidroxi-kumarin dilantin = 5,5-difenil-hidantoin-nátriumsó 5 0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
