179497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az inzulin-kiválasztást befolyásoló biológiailag hatásos anyag előállítására Bordetella-pertussis felhasználásával
13 179497 14 Az aktív anyagot mint egyetlen csúcsot 65 000 ± ± 7 000 molekulasúlytartományban kapjuk (amit később, átfolyó jelzőproteinnal döntöttünk el), ami az aktivitáscsúccsal megegyezik. Az aktív anyagot ötször 48 órán át, 2 liter vízzel szemben dializáljuk, majd liofilizáljuk, ekkor 2,1 mg fehér port kapunk. Az így kapott termék poliakrilamidgél-elektroforézisnél (gél pH = 4,3) egyetlen sávot ad, összetételét tekintve proteintartalma 98% felett van, és sem szénhidrátot, sem lipoidot nem tartalmaz. A p-acetoximerkurianilin (PAMA)-Sepharose 6MB előállítását a következőképpen végezzük: 4 g cianobromiddal aktivált Sepharose 6MB gélt (a Pharmacia Fine Chemicals kereskedelmi terméke) többször átmossuk, és üvegszűrőn 1 liter 10'3 n sósavval duzzasztjuk. Külön elkészítünk egy oldatot úgy, hogy 172 mg (0,5 mM) p-acetoximerkurianilint 0. 1 M nátriumkarbonátpuffer (pH = 8,3, 0,5 M nátriumkloridot tartalmaz) 60%-os dimetilformamidos oldatának 50 ml-ében oldunk. A gél mosásának és duzzasztásának befejezése után hozzáadjuk a fenti oldatot, és a keveréket szobahőmérsékleten (22-25 °C) 2 órán át erélyesen rázzuk. A reakció befejeződése után a terméket a fenti pufferral jól átmossuk, a gélhez 50 ml 1 M monoetanolamint (pH = 9,0) adunk, és a keveréket 2 órán át szobahőmérsékleten alaposan rázzuk. Ezután a gélt üvegszürőn leszívatjuk, 1 liter 0,1 M borátpufferral (pH = 8,5) és 1 liter 0,1 M acetátpufferral (pH = 4,0) felváltva többször mossuk, végül 0,1 M nátriumkloridot tartalmazó 0,01 M acetátpufferral (pH = 4,5) vagy 0,1 M lítiumklorid-sósav keverékkel (pH = 4,5) egyensúlyba hozzuk. Adott esetben a gélt előzőleg 1% 2-merkaptoetanolt tartalmazó, fentivel azonos pufferral kezeljük, ezután alaposan átmossuk, és ugyanezzel a pufferral egyensúlyba hozzuk. B) Liofüizált és konzervált patogén Bordetella pertussis mikroorganizmusokat (I fázisú Tohama Törzs) (Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) az 1. példa 1. pontja szerint tenyésztünk, és a folyékony tenyészet így kapott 10 liter felülúszó részét 60 ml/óra átfolyási sebességgel 5x2 cm-es hidroxiapatit oszlopra vezetjük, majd 300 ml 0,01 M foszfátpufferral (pH = 7,0) mossuk, és ezután 15 ml/óra sebességgel 0,1 M foszfátpuffert (pH = 7,0) engedünk át az oszlopon. Az így kapott aktív anyagot „Ficol 400”-zal (a Pharmacia Fine Chemicals kereskedelmi terméké) koncentráljuk, és négyszer (összesen 24 órán át) 2 liter desztillált vízzel és négyszer (összesen 24 órán át) 1 liter 0,01 M foszfátpufferral (pH = 7,0) szemben dializáljuk, és ezzel a pufferral egyensúlyba hozzuk. Az aktív anyagot ezután 1,8 x 13 cm-es Anti-IAP Antikörper-Sepharose 4B oszlopra (előállítását lásd később) vezetjük, 0,1 M nátriumkloridot tartalmazó kb. 200 ml 0,01 M foszfátpufferral (pH = 7,0) jól átmossuk, majd 60 ml/óra átfolyási sebességgel 2 mM etiléndiamintetraecetsav-nátriumot és 0,15 M nátriumkloridot tartalmazó 0,1 M glicin-sósav keverékkel (pH = 3,0) eluáljuk. Az eluátumot glicinpufferral (pH =11,5) azonnal semlegesítjük. Az aktív anyagot összegyűjtjük, és (háromszor 48 órán át) 5 liter desztillált vízzel szemben dializáljuk. 1,9 mg fehér port kapunk. Az anyag molekulasúlya gélszűréssel mérve 70 000 ± 5 000. Az anyag poliakrilamid-gél-elektroforézissel (gél pH = 4,3) egyetlen sávot ad. Az anyag összetétele: kb. 97% vagy ennél több protein, 1% vagy ennél kevesebb szénhidrát, lipoid nem mutatható ki. Az Anti-IAP Antikörper-Sepharose 4B előállítását a következőképpen végezzük: 10 g cianobromiddal aktivált „Sepharose 4B” gélt (a Pharmacia Fine Chemicals kereskedelmi terméke) üvegszűrőn 2 liter 10“3 n sósav alkalmazásával mosunk, és ismételten duzzasztunk. Külön elkészítünk egy oldatot úgy, hogy 100 g Anti-IAP antitestet (IAP = Islets-Aktivierungs-Protein) 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 50 ml 0,1 M nátriumhidrogénkarbonát pufferban (pH = 8,3) feloldunk. A mosás és duzzasztás befejezése után a gélhez azonnal hozzáadjuk a fenti oldatot és a keveréket 2 órán át szobahőmérsékleten (22-25 °C) erélyesen rázzuk. A reakció befejeződése után a gélt üvegszűrőn leszívatjuk, és a feleslegben levő Anti-IAP antitest eltávolítása céljából a fentivel azonos pufferral többször mossuk, majd 100 ml 1 M monoetanolamint adunk hozzá, és a keveréket alapos átkeverés céljából 2 órán át erélyesen rázzuk. A reagáltatás után a gélt a fenti pufferral többször mossuk, majd 0,5 M nátriumkloridot tartalmazó 1 liter 0,1 M ecetsav-pufferral (pH = 4,0) mossuk (ezt a műveletet pH-változtatással háromszor megismételjük). Végül a terméket 1 liter fenti pufferral a megadott módon mossuk. (A gél tartósítását 4-8 °C-on végezzük.) 2. példa A proteinjellegű aktív anyag farmakológiai tulajdonságai 1. Az inzulinkiválasztást elősegítő hatás meghatározása \ szigeteket-aktiváló-protein és az ezzel ekvivalens vegyületek inzulinkiválasztást elősegítő hatását meghatározhatjuk az állatok magatartását mérve különböző fajta, inzulinkiválasztást stimuláló anyagokkal szemben, ahol erre a célra stimulánsként általában glükózt használunk. \ kísérleti állatok hím Wistar-patkányok, amelyeknek testsúlya 130-140 g. A kísérleti eljárás a következő: a nyers-tisztaságú vagy nagytisztaságú, különböző erősségű aktív anyagokat fiziológiás konyhasóoldatban feloldjuk, és ezeknek az oldatoknak mindenkor 0,2 ml-ét az éterrel altatott kísérleti patkányok femorális vénájába intravénás injekcióban beadjuk, és valamennyi anyag inzulinkiválasztást serkentő hatását 3 nappal később mérjük. A patkányokat a kísérlet előtti 18-20 órában éheztetjük. Az aktivitás mérése céljából minden patkány farokvénájából 0,1 ml vért veszünk, rögtön ezután 1 ml/100 g testsúly mennyiségben 30%-os glükózoldatot intraperitoneális injekcióban beadunk az álla7 5 10 !5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
